УДК 636.5.087.8
Часть 1
КОЩАЕВ Андрей Георгиевич
ЛЫСЕНКО Юрий Андреевич
ЛУНЕВА Альбина Владимировна
МАЧНЕВА Надежда Леонидовна
БОЙКО Алексей Андреевич
МУРТАЗАЕВ Курбан Нажмудинович
Кубанский государственный аграрный университет
КОЩАЕВ Андрей Георгиевич
ЛЫСЕНКО Юрий Андреевич
ЛУНЕВА Альбина Владимировна
МАЧНЕВА Надежда Леонидовна
БОЙКО Алексей Андреевич
МУРТАЗАЕВ Курбан Нажмудинович
Кубанский государственный аграрный университет
Ключевые слова: технология получения, пробиотик, безопасность, токсичность, лабораторные животные, эффективность, перепела, цыплята-бройлеры, сохранность, прирост, показатели качества.
В работе представлены результаты по технологии получения кормовой добавки микробного происхождения, в частности пробиотической добавки на основе автохтонной микрофлоры сельскохозяйственной птицы, а также эффективность её применения на перепелах и цыплятах-бройлерах.
Установлено, что эволюционно-закрепленная микрофлора птицы безопасна для использования, обладает высокими пробиотическими свойствами, подавляет рост и адгезивные свойства патогенной микрофлоры.
Пробиотическая добавки на основе изучаемых культур лактобацилл способствовала повышению сохранности птицы, приросту их живой массы, улучшению показателя биобезопасности продукции птицеводства, а также усилению обменных процессов организма и иммунитета.
Введение.
Одной из главной задач аграрной политики Российской Федерации на период до 2020 года является обеспечение потребностей населения страны продуктами питания сельскохозяйственного назначения собственного изготовления [3, с. 6; 12, с. 12].
Значительная роль в выполнении этой стратегической задачи принадлежит птицеводству, как одной из рентабельных отраслей сельского хозяйства. Однако, существенный экономический ущерб промышленному птицеводству наносят болезни сельскохозяйственной птицы бактериальной этиологии. Поэтому, в 70-е годы прошлого века начался поиск экономически целесообразных и экологически безопасных средств профилактики и терапии болезней сельскохозяйственной птицы, к которым в частности относятся кормовые добавки на основе полезных микроорганизмов [6, с. 117; 10, с. 15; 16, с. 679].
Важнейшей задачей при конструировании пробиотиков является отбор бактериальных штаммов, способных эффективно колонизировать желудочно-кишечный тракт и оставаться активными в течение длительного времени [1, с. 212].
Нормальная микрофлора желудочно-кишечного тракта характеризуется качественным и количественным соотношением в различных его отделах популяций микроорганизмов, способных поддерживать метаболическое и иммунное равновесие макроорганизма. Основная роль в этом принадлежит молочнокислым бактериям, которые являются обязательной составляющей полезной микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных и птиц [8, с. 24].
Изучение научной и патентной литературы показало, что на сегодняшний день не достаточно эффективных конструкций функционально-адаптированных кормовых добавок, изготовленных с применением эволюционно-закрепленной микрофлоры желудочно-кишечного тракта птицы для применения в промышленном птицеводстве.
Одной из главной задач аграрной политики Российской Федерации на период до 2020 года является обеспечение потребностей населения страны продуктами питания сельскохозяйственного назначения собственного изготовления [3, с. 6; 12, с. 12].
Значительная роль в выполнении этой стратегической задачи принадлежит птицеводству, как одной из рентабельных отраслей сельского хозяйства. Однако, существенный экономический ущерб промышленному птицеводству наносят болезни сельскохозяйственной птицы бактериальной этиологии. Поэтому, в 70-е годы прошлого века начался поиск экономически целесообразных и экологически безопасных средств профилактики и терапии болезней сельскохозяйственной птицы, к которым в частности относятся кормовые добавки на основе полезных микроорганизмов [6, с. 117; 10, с. 15; 16, с. 679].
Важнейшей задачей при конструировании пробиотиков является отбор бактериальных штаммов, способных эффективно колонизировать желудочно-кишечный тракт и оставаться активными в течение длительного времени [1, с. 212].
Нормальная микрофлора желудочно-кишечного тракта характеризуется качественным и количественным соотношением в различных его отделах популяций микроорганизмов, способных поддерживать метаболическое и иммунное равновесие макроорганизма. Основная роль в этом принадлежит молочнокислым бактериям, которые являются обязательной составляющей полезной микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных и птиц [8, с. 24].
Изучение научной и патентной литературы показало, что на сегодняшний день не достаточно эффективных конструкций функционально-адаптированных кормовых добавок, изготовленных с применением эволюционно-закрепленной микрофлоры желудочно-кишечного тракта птицы для применения в промышленном птицеводстве.
Методика исследований.
Научно-исследовательская работа осуществлялась на базе ФГБОУ ВО Кубанский ГАУ, на кафедре биотехнологии, биохимии и биофизики. Эксперименты на лабораторных животных и сельскохозяйственной птице проводились в научно-исследовательских лабораториях кафедры биотехнологии, биохимии и биофизики и виварии факультета ветеринарной медицины КубГАУ.
В научно-исследовательской работе использовали жидкую пробиотическую добавку Трилактокор, состоящую из композиции трех видов коровых лактобацилл (Lactobacillus intermedius, Lactobacillus agilis и Lactobacillus salivarius), выделенных из желудочно-кишечного тракта перепелов.
Анализ относительной представленности таксономических групп бактерий проводили методом ПЦР в реальном времени из образцов метагеномной ДНК отделов желудочно-кишечного тракта перепелов с использованием набора реактивов ПЦР-Микс (Синтол, Россия) согласно инструкции производителя. Геномная ДНК бактерий выделялась с использованием набора реагентов – Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific, CША) согласно наставлению изготовителя.
Чистоту образцов после выделения качественно оценивали методом электрофореза в 1%-м агарозном геле. Окрашивание проводили интеркалирующим красителем – бромистым этидием.
Первичную оценку титра колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизмов проводили путем прямого высева дробных разведений на чашки Петри с богатыми и селективными агаризованными питательными средами.
Амплификация ДНК-фрагмента вариантов гена 16S рРНК длиной 1500 п.о. осуществлялась с помощью праймеров. При сравнении нуклеотидной последовательности полученных ДНК-фрагментов с известными структурами бактериальных генов, содержащихся в базе данных GenBank, устанавливалась принадлежность штаммов к определенному виду. Выделение тотальной геномной ДНК из биомассы индивидуальных штаммов осуществлялось аналогично выделению метагеномной ДНК из образцов химуса.
Для подтверждения видоспецифичности новых бактериальных штаммов, выделеных из ЖКТ перепелов, дополнительно применялись такие методы фингерпринтинга, как ERIC-ПЦР и (GTG)5–ПЦР [14, с. 241; 15, с. 451].
Для подтверждения полученных данных и уточнения филогенетического родства выделенных штаммов, также использовались методы биоинформационного анализа. Все экспериментально полученные последовательности генов 16S рРНК были соотнесены с последовательностями из базы данных GenBank.
По общепринятым методикам проводилось изучение основных культурально-морфологических показателей выделенных лактобацилл. В качестве биохимических свойств выделенных лактобацилл проводили определение спектра сбраживаемости сахаров, потребность молочнокислых микроорганизмов в отдельных витаминах, а также активное кислотообразование исследуемых лактобацилл.
Для выявления пробиотического потенциала исследуемых культур изучали их устойчивость к желчи, раствору фенола, хлорида натрия и желудочному соку. Резистентность штаммов определяли к терапевтическим дозам антимикробных веществ диско-диффузионным методом в агар с использованием стандартных дисков [7, с. 15].
Антагонистическую активность молочнокислых микроорганизмов по отношению к полевым патогенным штаммам изучали диффузионными методами (in vitro): методом агаровых слоев, лунок, перпендикулярных штрихов и капель в различных модификациях. Дополнительно изучали антагонистические свойства лактобацилл по отношению к лабораторным (эталонным) тест-культурам патогенной и условно-патогенной микрофлоры различных групп методом отсроченного антагонизма [7, с. 24].
В качестве дополнительных методов исследования пробиотического потенциала исследуемых микроорганизмов проводили изучение антиадгезивных (прямой и косвенный метод) и адгезивных свойств штаммов на клеточных моделях [7, с. 27].
В качестве дополнительных методов исследования безопасности используемых культур лактобактерий проводили изучение гемолитической активности invitroи безвредности штаммов in vivo [7, с. 33]. Для интенсификации процессов получения биомассы выделенных лактобацилл проводили определение их питательных потребностей и оптимальных условий культивирования. Титр лактобацилл определяли согласно ГОСТ 10444.11-89.
В процессе культивирования микроорганизмов проводился анализ динамики потребления редуцирующих веществ согласно ГОСТ 8756.13-87.
Оценку пробиотической эффективности использования консорциума выделенных культур в составе разработанного пробиотика Трилактокор, а также отдельно каждого штамма проводили на модели экспериментального дисбактериоза у белых лабораторных беспородных мышей и 4 крыс [5, с. 449].
Изучение параметров токсичности разрабатываемой кормовой добавки микробного происхождения проводили согласно рекомендаций [13, с. 342]. Изучение кожно-резорбтивного действия и раздражающего свойства на слизистые оболочки глаз проводили на кроликах-альбиносах согласно ГОСТ Р ИСО 10993.10-99. Изучение острой, подострой и хронической токсичностей проводили на клинически здоровых лабораторных животных (мыши, крысы), предварительно прошедших карантин в течение 14 дней.
Эффективность использования пробиотической добавки изучалось на перепелах мясной породы Техасские белые и цыплятах-бройлерах кросса Росс 308 (табл. 1).
Научно-исследовательская работа осуществлялась на базе ФГБОУ ВО Кубанский ГАУ, на кафедре биотехнологии, биохимии и биофизики. Эксперименты на лабораторных животных и сельскохозяйственной птице проводились в научно-исследовательских лабораториях кафедры биотехнологии, биохимии и биофизики и виварии факультета ветеринарной медицины КубГАУ.
В научно-исследовательской работе использовали жидкую пробиотическую добавку Трилактокор, состоящую из композиции трех видов коровых лактобацилл (Lactobacillus intermedius, Lactobacillus agilis и Lactobacillus salivarius), выделенных из желудочно-кишечного тракта перепелов.
Анализ относительной представленности таксономических групп бактерий проводили методом ПЦР в реальном времени из образцов метагеномной ДНК отделов желудочно-кишечного тракта перепелов с использованием набора реактивов ПЦР-Микс (Синтол, Россия) согласно инструкции производителя. Геномная ДНК бактерий выделялась с использованием набора реагентов – Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific, CША) согласно наставлению изготовителя.
Чистоту образцов после выделения качественно оценивали методом электрофореза в 1%-м агарозном геле. Окрашивание проводили интеркалирующим красителем – бромистым этидием.
Первичную оценку титра колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизмов проводили путем прямого высева дробных разведений на чашки Петри с богатыми и селективными агаризованными питательными средами.
Амплификация ДНК-фрагмента вариантов гена 16S рРНК длиной 1500 п.о. осуществлялась с помощью праймеров. При сравнении нуклеотидной последовательности полученных ДНК-фрагментов с известными структурами бактериальных генов, содержащихся в базе данных GenBank, устанавливалась принадлежность штаммов к определенному виду. Выделение тотальной геномной ДНК из биомассы индивидуальных штаммов осуществлялось аналогично выделению метагеномной ДНК из образцов химуса.
Для подтверждения видоспецифичности новых бактериальных штаммов, выделеных из ЖКТ перепелов, дополнительно применялись такие методы фингерпринтинга, как ERIC-ПЦР и (GTG)5–ПЦР [14, с. 241; 15, с. 451].
Для подтверждения полученных данных и уточнения филогенетического родства выделенных штаммов, также использовались методы биоинформационного анализа. Все экспериментально полученные последовательности генов 16S рРНК были соотнесены с последовательностями из базы данных GenBank.
По общепринятым методикам проводилось изучение основных культурально-морфологических показателей выделенных лактобацилл. В качестве биохимических свойств выделенных лактобацилл проводили определение спектра сбраживаемости сахаров, потребность молочнокислых микроорганизмов в отдельных витаминах, а также активное кислотообразование исследуемых лактобацилл.
Для выявления пробиотического потенциала исследуемых культур изучали их устойчивость к желчи, раствору фенола, хлорида натрия и желудочному соку. Резистентность штаммов определяли к терапевтическим дозам антимикробных веществ диско-диффузионным методом в агар с использованием стандартных дисков [7, с. 15].
Антагонистическую активность молочнокислых микроорганизмов по отношению к полевым патогенным штаммам изучали диффузионными методами (in vitro): методом агаровых слоев, лунок, перпендикулярных штрихов и капель в различных модификациях. Дополнительно изучали антагонистические свойства лактобацилл по отношению к лабораторным (эталонным) тест-культурам патогенной и условно-патогенной микрофлоры различных групп методом отсроченного антагонизма [7, с. 24].
В качестве дополнительных методов исследования пробиотического потенциала исследуемых микроорганизмов проводили изучение антиадгезивных (прямой и косвенный метод) и адгезивных свойств штаммов на клеточных моделях [7, с. 27].
В качестве дополнительных методов исследования безопасности используемых культур лактобактерий проводили изучение гемолитической активности invitroи безвредности штаммов in vivo [7, с. 33]. Для интенсификации процессов получения биомассы выделенных лактобацилл проводили определение их питательных потребностей и оптимальных условий культивирования. Титр лактобацилл определяли согласно ГОСТ 10444.11-89.
В процессе культивирования микроорганизмов проводился анализ динамики потребления редуцирующих веществ согласно ГОСТ 8756.13-87.
Оценку пробиотической эффективности использования консорциума выделенных культур в составе разработанного пробиотика Трилактокор, а также отдельно каждого штамма проводили на модели экспериментального дисбактериоза у белых лабораторных беспородных мышей и 4 крыс [5, с. 449].
Изучение параметров токсичности разрабатываемой кормовой добавки микробного происхождения проводили согласно рекомендаций [13, с. 342]. Изучение кожно-резорбтивного действия и раздражающего свойства на слизистые оболочки глаз проводили на кроликах-альбиносах согласно ГОСТ Р ИСО 10993.10-99. Изучение острой, подострой и хронической токсичностей проводили на клинически здоровых лабораторных животных (мыши, крысы), предварительно прошедших карантин в течение 14 дней.
Эффективность использования пробиотической добавки изучалось на перепелах мясной породы Техасские белые и цыплятах-бройлерах кросса Росс 308 (табл. 1).
Таблица 1
Каждый день велось наблюдение за клинико-физиологическим состоянием птицы путем осмотра поголовья, обращали внимание на поведение, подвижность, перьевой покров, поедаемость корма и потребление воды.
Рассчитывали процент сохранности птицы за весь период эксперимента. Еженедельно осуществляли изучение динамики живой массы птиц, путем индивидуального взвешивания. По разнице начальной и конечной масс рассчитывали прирост птицы. Ежедневно вёлся учёт за расходом кормов птицей. Конверсию рассчитывали как отношение съеденного корма к 1 кг прироста птицы за весь период исследований [4, с. 17].
Для изучения показателей мясной продуктивности после применения кормовой добавки в рационе птиц в конце исследований проводили их убой и анатомическую разделку. Проводили ветеринарно-санитарную экспертизу мяса птицы. Органолептические показатели, упитанность, а также микробиологическую чистоту мяса птицы изучали согласно нормативной документации [9, с. 25].
Изучался морфологический статус крови с.-х. птицы и лабораторных животных. Количество клеток (эритроциты, лейкоциты и тромбоциты) в цельной крови подсчитывалось в камере с сеткой Горяева. Содержание гемоглобина в эритроцитах измеряли на анализаторе НemoCue Hb. Биохимические показатели сыворотки крови подопытных животных и птиц изучали на полуавтоматическом настольном анализаторе Statfax4500. Invitro анализировали бактерицидную и лизоцимную активность сыворотки крови согласно методикам [11, с. 54].
Для изучения микробного фона желудочно-кишечного тракта после убоя птиц проводили резекцию отделов кишечника [2, с. 27−39].
Расчеты экономической целесообразности применения добавки на сельскохозяйственной птице осуществляли с учетом их стоимости, количества съеденного корма и сохранности птицепоголовья. Учитывали фактическую стоимость кормов и цену продукции птицеводства в период проведения опытов.
Полученные в опытах данные подвергались биометрической обработке с помощью программного обеспечения фирмы Microsoft. Критерий достоверности определяли по таблице Стъюдента. Разницу считали достоверной при Р < 0,05.
Результаты исследований. Профилирование микробиома перепела по отделам ЖКТ. Бактериальная геномная ДНК выделялась из свежих образцов отделов ЖКТ японского перепела (зоб, мускульный желудок, слепая кишка, подвздошная кишка, а также нижняя треть прямой кишки) породы «японские серые».
Чистоту образцов качественно оценивали при помощи электрофореза в 1%-м агарозном геле при окрашивании бромистым этидием (рис. 1).
На электрофореграмме видно равномерное распределение по дорожке (треку) фрагментов мета-генномной ДНК разной длины.
Подбор и синтез специфичных праймеров для таксономической идентификации групп бактерий.
Нуклеотидная последовательность праймеров составлялась с помощью программы PerlPrimer. Используемые в работе праймеры представлены в табл. 2.
Рассчитывали процент сохранности птицы за весь период эксперимента. Еженедельно осуществляли изучение динамики живой массы птиц, путем индивидуального взвешивания. По разнице начальной и конечной масс рассчитывали прирост птицы. Ежедневно вёлся учёт за расходом кормов птицей. Конверсию рассчитывали как отношение съеденного корма к 1 кг прироста птицы за весь период исследований [4, с. 17].
Для изучения показателей мясной продуктивности после применения кормовой добавки в рационе птиц в конце исследований проводили их убой и анатомическую разделку. Проводили ветеринарно-санитарную экспертизу мяса птицы. Органолептические показатели, упитанность, а также микробиологическую чистоту мяса птицы изучали согласно нормативной документации [9, с. 25].
Изучался морфологический статус крови с.-х. птицы и лабораторных животных. Количество клеток (эритроциты, лейкоциты и тромбоциты) в цельной крови подсчитывалось в камере с сеткой Горяева. Содержание гемоглобина в эритроцитах измеряли на анализаторе НemoCue Hb. Биохимические показатели сыворотки крови подопытных животных и птиц изучали на полуавтоматическом настольном анализаторе Statfax4500. Invitro анализировали бактерицидную и лизоцимную активность сыворотки крови согласно методикам [11, с. 54].
Для изучения микробного фона желудочно-кишечного тракта после убоя птиц проводили резекцию отделов кишечника [2, с. 27−39].
Расчеты экономической целесообразности применения добавки на сельскохозяйственной птице осуществляли с учетом их стоимости, количества съеденного корма и сохранности птицепоголовья. Учитывали фактическую стоимость кормов и цену продукции птицеводства в период проведения опытов.
Полученные в опытах данные подвергались биометрической обработке с помощью программного обеспечения фирмы Microsoft. Критерий достоверности определяли по таблице Стъюдента. Разницу считали достоверной при Р < 0,05.
Результаты исследований. Профилирование микробиома перепела по отделам ЖКТ. Бактериальная геномная ДНК выделялась из свежих образцов отделов ЖКТ японского перепела (зоб, мускульный желудок, слепая кишка, подвздошная кишка, а также нижняя треть прямой кишки) породы «японские серые».
Чистоту образцов качественно оценивали при помощи электрофореза в 1%-м агарозном геле при окрашивании бромистым этидием (рис. 1).
На электрофореграмме видно равномерное распределение по дорожке (треку) фрагментов мета-генномной ДНК разной длины.
Подбор и синтез специфичных праймеров для таксономической идентификации групп бактерий.
Нуклеотидная последовательность праймеров составлялась с помощью программы PerlPrimer. Используемые в работе праймеры представлены в табл. 2.
Рис. 1
Таблица 2
Использовали следующие комбинации праймеров: DomBac_F/DomBac_R (1/2) – для идентификации последовательности гена 16S рРНК общего для всего домена Bacteria; EnteroBac_F/EnteroBac_R
(3/4) – для семейства Enterobacteriaceae; LacBacil_F/LacBacil_R (5/6) – для семейства лактобацилл (Lactobacillaceae). Также дополнительно применялась пара праймеров LBacill_F/LBacill_R (11/12), которая специфична к представителям рода Lactobacillus. Пары праймеров Enterococ_F/Enterococ_R
(7/8), BifBac_F/BifBac_R (9/10) и Escher_F/Escher_R (13/14) были специфичны для родов Enterococcus, Bifidobacterium и Escherichia соответственно.
Анализ относительной представленности таксон-специфических вариантов гена 16S рРНК превалирующих групп бактерий-пробионтов. На рисунке 2 представлены результаты изучения содержимого пяти отделов ЖКТ перепела и распределение в них микроорганизмов различных таксономических групп, полученные методом количественной ПЦР.Образцы нормировали по уровню сигнала пары праймеров DomBac_F / DomBac_R.
Из рис. 2 видно, что максимальное относительное содержание лактобактерий, а также профиль распределения представителей основных семейств бактерий отмечался в химусе слепой кишки.
(3/4) – для семейства Enterobacteriaceae; LacBacil_F/LacBacil_R (5/6) – для семейства лактобацилл (Lactobacillaceae). Также дополнительно применялась пара праймеров LBacill_F/LBacill_R (11/12), которая специфична к представителям рода Lactobacillus. Пары праймеров Enterococ_F/Enterococ_R
(7/8), BifBac_F/BifBac_R (9/10) и Escher_F/Escher_R (13/14) были специфичны для родов Enterococcus, Bifidobacterium и Escherichia соответственно.
Анализ относительной представленности таксон-специфических вариантов гена 16S рРНК превалирующих групп бактерий-пробионтов. На рисунке 2 представлены результаты изучения содержимого пяти отделов ЖКТ перепела и распределение в них микроорганизмов различных таксономических групп, полученные методом количественной ПЦР.Образцы нормировали по уровню сигнала пары праймеров DomBac_F / DomBac_R.
Из рис. 2 видно, что максимальное относительное содержание лактобактерий, а также профиль распределения представителей основных семейств бактерий отмечался в химусе слепой кишки.
Рис. 2
Микробиологический анализ групп бактерий-пробионтов. В полученных суспензиях, из химуса отделов ЖКТ перепела, первичную оценку титра (КОЕ) проводили путем прямого высева дробных разведений на чашки Петри с богатыми и селективными агаризованными средами.
Изоляция индивидуальных клонов микроорганизмов. После приготовления накопительных культур, отбор отдельных колоний проводился на селективных средах, путём прямого высева дробных разведений. Выращивание проводили на поверхности плотных агаризованных селективных питательных сред. В результате проделанной работы была составлена коллекция из индивидуальных изолятов штаммов целевых рода Lactobacillus.
Таксономическая идентификация и молекулярно-генетический анализ пула штаммов. Микробиологическая характеризация штаммов пробиотически значимых рода Lactobacillus включала в себя стадии получения накопительных культур, высева разведений обогащенных культур на селективные среды, отбора колоний наиболее представленных морфологических форм, получения чистых культур и их типирования с использованием праймеров (см. табл. 2).
Для последующей таксономической идентификации штаммов из собранной биомассы выделялась хромосомная ДНК аналогично выделению метагеномной ДНК из образцов химуса. Амплификация ДНК-фрагмента вариантов гена 16S рРНК длиной 1500 п.о. осуществлялась с помощью праймеров (табл. 3).
Изоляция индивидуальных клонов микроорганизмов. После приготовления накопительных культур, отбор отдельных колоний проводился на селективных средах, путём прямого высева дробных разведений. Выращивание проводили на поверхности плотных агаризованных селективных питательных сред. В результате проделанной работы была составлена коллекция из индивидуальных изолятов штаммов целевых рода Lactobacillus.
Таксономическая идентификация и молекулярно-генетический анализ пула штаммов. Микробиологическая характеризация штаммов пробиотически значимых рода Lactobacillus включала в себя стадии получения накопительных культур, высева разведений обогащенных культур на селективные среды, отбора колоний наиболее представленных морфологических форм, получения чистых культур и их типирования с использованием праймеров (см. табл. 2).
Для последующей таксономической идентификации штаммов из собранной биомассы выделялась хромосомная ДНК аналогично выделению метагеномной ДНК из образцов химуса. Амплификация ДНК-фрагмента вариантов гена 16S рРНК длиной 1500 п.о. осуществлялась с помощью праймеров (табл. 3).
Таблица 3
При сравнении нуклеотидной последовательности полученных ДНК-фрагментов с известными структурами бактериальных генов, содержащихся в базе данных GenBank, устанавливалась принадлежность штаммов к определенному виду.
Молекулярное типирование отобранных штаммов. После получения ряда чистых культур и определения их видовой принадлежности, внимание было сосредоточено на индивидуальные штаммы рода Lactobacillus, которые былиотнесены к видам Lb. salivarius, Lb. agilis и Lb. intermedius.
Для подтверждения видоспецифичности новых бактериальных штаммов, выделенных из естественных сред, дополнительно рекомендовано применять такие методы фингерпринтинга, как ERIC-ПЦР и (GTG)5–ПЦР.Полученные новые клоны сравнили с референтной культурой Lactobacillus helveticus [13LcAc]. Установлено, что выделенные штаммы обладали сходными, но не идентичными профилями.
Биоинформационный анализ структуры 16S рРНК пула штаммов-пробионтов и построение филогенетических деревьев. Для подтверждения ранее полученных данных и уточнения филогенетического родства выделенных штаммов, было решено также использовать методы биоинформационного анализа.
На филогенетическом древе (рис. 3) новые штаммы сформировали четкий кластер, отличный от референтного штамма Lb. helveticus, причем Lb. salivarius и Lb. intermedius демонстрировали большую степень филогенетического родства между собой, чем с Lb. agilis.
Молекулярное типирование отобранных штаммов. После получения ряда чистых культур и определения их видовой принадлежности, внимание было сосредоточено на индивидуальные штаммы рода Lactobacillus, которые былиотнесены к видам Lb. salivarius, Lb. agilis и Lb. intermedius.
Для подтверждения видоспецифичности новых бактериальных штаммов, выделенных из естественных сред, дополнительно рекомендовано применять такие методы фингерпринтинга, как ERIC-ПЦР и (GTG)5–ПЦР.Полученные новые клоны сравнили с референтной культурой Lactobacillus helveticus [13LcAc]. Установлено, что выделенные штаммы обладали сходными, но не идентичными профилями.
Биоинформационный анализ структуры 16S рРНК пула штаммов-пробионтов и построение филогенетических деревьев. Для подтверждения ранее полученных данных и уточнения филогенетического родства выделенных штаммов, было решено также использовать методы биоинформационного анализа.
На филогенетическом древе (рис. 3) новые штаммы сформировали четкий кластер, отличный от референтного штамма Lb. helveticus, причем Lb. salivarius и Lb. intermedius демонстрировали большую степень филогенетического родства между собой, чем с Lb. agilis.
Рис. 3
Биоинформационный анализ вариантов последовательностей гена 16S рРНК идентифицированных штаммов рода Lactobacillus полностью подтвердил ранее полученные данные молекулярного типирования.
Разработка тест-системы для контроля нормофлоры лактобацилл ЖКТ Coturnix coturnix. Проведен анализ нуклеотидных последовательностей вариантов гена 16S рРНК видов Lb. agilis, Lb. intermedius и Lb. salivarius, позволивший выявить зоны полиморфизмов и разработать дизайн видоспецифичных праймеров (табл. 4).
Разработка тест-системы для контроля нормофлоры лактобацилл ЖКТ Coturnix coturnix. Проведен анализ нуклеотидных последовательностей вариантов гена 16S рРНК видов Lb. agilis, Lb. intermedius и Lb. salivarius, позволивший выявить зоны полиморфизмов и разработать дизайн видоспецифичных праймеров (табл. 4).
Таблица 4
Полученные наборы праймеров для детекции вариантов генов 16S рРНК видов Lb. agilis, Lb. inter- medius и Lb. salivarius соответствовали необходимым требованиям. С помощью разработанного набора праймеров было проведено количественное ПЦР с целью определения видового соотношения превалирующих лактобактерий различных отделов ЖКТ перепела.
Установлено, что максимальное относительное содержание лактобактерий отмечалось в слепой кишке, где также проявлялось максимальное видовое разнообразие этой группы. Применение тест-системы позволило установить, что в содержимом слепой кишки перепела превалировали целевые виды семейства Lactobacillaceae — Lb. agilis, Lb. intermedius и Lb. salivarius. Полученные данные коррелировали с результатами, полученными при прямом подсчете отдельных колоний после высева на селективные среды дробных разведений содержимого слепых отростков ЖКТ.
В целом, при анализе нормальной микрофлоры ЖКТ перепела независимыми микробиологическими методами (прямой подсчет колоний при высевах на селективные среды с идентификацией до вида на видоспецифичных праймерах к последовательности гена 16S рРНК), методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени и метагеномными методами продемонстрировано, что более 85% видового состава лактобактерий приходится на три основных коровых вида — Lb. agilis, Lb. intermedius иLb. salivarius в соотношении близком к 2: 2: 1 соответственно. Таким образом, данные культуры, были взяты как основа для разработки пробиотической кормовой добавки.
Изучение культурально-морфологических и биологических свойств культур. Проведенные исследования показали, что выделенные из ЖКТ перепелов лактобациллыобладают признаками и свойствами, характерными для молочнокислых бактерий, обладают высокой кислотообразующей способность, резистентность к фенолу, желчи, хлориду натрия, желудочному соку, способны утилизировать широкий спектр сахаров (глюкозу, арабинозу, мальтозу, целлобиозу, фруктозу, лактозу, раффинозу и сахарозу), что даёт им преимущества при конкуренции за субстрат.
Изучение антибиотикорезистентности лактобацилл. Согласно критериям оценки чувствительности лактобактерий, с учетом диаметра зоны ингибирования их роста все используемые культуры можно было отнести к категории «устойчивые» к действию применяемых антимикробных веществ.
В результате селекционного отбора (многократных пересевов) удалось уменьшить зоны ингибиции роста исследуемых штаммов к используемым концентрациям антибиотиков как минимум в 2 раза, а в отдельных случаях штаммы вообще не образовывали зон угнетения.
Антагонизм к полевой и эталонной патогенной микрофлоре. Установлено, что зоны задержки полевых тест-культур при использовании различных диффузионных методов находилась в пределах 2−14 мм. Использование метода перпендикулярных штрихов показало зону ингибирования роста — 5−14 мм, метода лунок — 2−3 мм, метода капель — 3−5 мм и метода агаровых слоев — 2−5 мм.
Влияние исследуемых лактобацилл на задержку роста эталонных тест-штаммов представлены в табл. 5.
Установлено, что максимальное относительное содержание лактобактерий отмечалось в слепой кишке, где также проявлялось максимальное видовое разнообразие этой группы. Применение тест-системы позволило установить, что в содержимом слепой кишки перепела превалировали целевые виды семейства Lactobacillaceae — Lb. agilis, Lb. intermedius и Lb. salivarius. Полученные данные коррелировали с результатами, полученными при прямом подсчете отдельных колоний после высева на селективные среды дробных разведений содержимого слепых отростков ЖКТ.
В целом, при анализе нормальной микрофлоры ЖКТ перепела независимыми микробиологическими методами (прямой подсчет колоний при высевах на селективные среды с идентификацией до вида на видоспецифичных праймерах к последовательности гена 16S рРНК), методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени и метагеномными методами продемонстрировано, что более 85% видового состава лактобактерий приходится на три основных коровых вида — Lb. agilis, Lb. intermedius иLb. salivarius в соотношении близком к 2: 2: 1 соответственно. Таким образом, данные культуры, были взяты как основа для разработки пробиотической кормовой добавки.
Изучение культурально-морфологических и биологических свойств культур. Проведенные исследования показали, что выделенные из ЖКТ перепелов лактобациллыобладают признаками и свойствами, характерными для молочнокислых бактерий, обладают высокой кислотообразующей способность, резистентность к фенолу, желчи, хлориду натрия, желудочному соку, способны утилизировать широкий спектр сахаров (глюкозу, арабинозу, мальтозу, целлобиозу, фруктозу, лактозу, раффинозу и сахарозу), что даёт им преимущества при конкуренции за субстрат.
Изучение антибиотикорезистентности лактобацилл. Согласно критериям оценки чувствительности лактобактерий, с учетом диаметра зоны ингибирования их роста все используемые культуры можно было отнести к категории «устойчивые» к действию применяемых антимикробных веществ.
В результате селекционного отбора (многократных пересевов) удалось уменьшить зоны ингибиции роста исследуемых штаммов к используемым концентрациям антибиотиков как минимум в 2 раза, а в отдельных случаях штаммы вообще не образовывали зон угнетения.
Антагонизм к полевой и эталонной патогенной микрофлоре. Установлено, что зоны задержки полевых тест-культур при использовании различных диффузионных методов находилась в пределах 2−14 мм. Использование метода перпендикулярных штрихов показало зону ингибирования роста — 5−14 мм, метода лунок — 2−3 мм, метода капель — 3−5 мм и метода агаровых слоев — 2−5 мм.
Влияние исследуемых лактобацилл на задержку роста эталонных тест-штаммов представлены в табл. 5.
Таблица 5
Выявлено, что антагонизм изучаемых лактобактерий в отношении эталонных тест-штаммов был выше, чем при влиянии на полевые тест-культуры и составил 8−27 мм.
Антиадгезивные свойства лактобацилл. Установлено, что исследуемые лактобактерии и их супернатанты обладали антиадгезивными свойствами, но в различной степени. Так, например, при влиянии лактобацилл на адгезию E. coliк эритроцитам крови барана в прямом методе выявлено, что наибольшими антиадгезивными свойствами (53,3%) обладала культура Lb. intermedius, в то время как её супернатант (косвенный метод) — 37,2%. В целом, нативные лактобациллы обладали более высокими значениями антиадгезии, чем их культуральные жидкости.
Адгезивные свойства лактобацилл. Результаты адгезивности лактобацилл по отношению к энтероцитам кишечника куриного эмбриона представлены в табл. 6.
Антиадгезивные свойства лактобацилл. Установлено, что исследуемые лактобактерии и их супернатанты обладали антиадгезивными свойствами, но в различной степени. Так, например, при влиянии лактобацилл на адгезию E. coliк эритроцитам крови барана в прямом методе выявлено, что наибольшими антиадгезивными свойствами (53,3%) обладала культура Lb. intermedius, в то время как её супернатант (косвенный метод) — 37,2%. В целом, нативные лактобациллы обладали более высокими значениями антиадгезии, чем их культуральные жидкости.
Адгезивные свойства лактобацилл. Результаты адгезивности лактобацилл по отношению к энтероцитам кишечника куриного эмбриона представлены в табл. 6.
Таблица 6
При подсчете количества микробных клеток, прикрепившихся к энтероцитам установлено, что все исследуемые культуры лактобацилл обладали высокоадгезивными свойствами, так как показатель СПА варьировал от 12,4 до 17,5 ед.
Безопасность исследуемых лактобацилл. В результате проведенного эксперимента, при выращивании лактокультур на 5 %-м кровяном агаре зоны лизиса вокруг них выявлено не было (результат гемолиза – отрицательный).
При пероральном введении мышам исследуемых культур лактобактерий в течении 5 дней, установлено, что во всех группах мышей не было зафиксировано гибели и заболевших животных, они оставались подвижными и активными, регистрировалась удовлетворительная поедаемость корма.
Таким образом, исследуемые культуры лактобацилл, безопасны для применения, они перспективны и их можно предложить в качестве основных объектов для конструирования добавки с высокой пробиотической активностью.
Подбор оптимальных условий культивирования отобранных штаммов.Для подбора питательного субстрата для исследуемых лактобацилл использовали следующие среды: для молочнокислых бактерий (среда Углич), МРС, ГПС, мелассо-автолизатная среда (МАС).Результаты по количеству исследуемых микробных культур, представлены на рис. 4.
Безопасность исследуемых лактобацилл. В результате проведенного эксперимента, при выращивании лактокультур на 5 %-м кровяном агаре зоны лизиса вокруг них выявлено не было (результат гемолиза – отрицательный).
При пероральном введении мышам исследуемых культур лактобактерий в течении 5 дней, установлено, что во всех группах мышей не было зафиксировано гибели и заболевших животных, они оставались подвижными и активными, регистрировалась удовлетворительная поедаемость корма.
Таким образом, исследуемые культуры лактобацилл, безопасны для применения, они перспективны и их можно предложить в качестве основных объектов для конструирования добавки с высокой пробиотической активностью.
Подбор оптимальных условий культивирования отобранных штаммов.Для подбора питательного субстрата для исследуемых лактобацилл использовали следующие среды: для молочнокислых бактерий (среда Углич), МРС, ГПС, мелассо-автолизатная среда (МАС).Результаты по количеству исследуемых микробных культур, представлены на рис. 4.
Рис. 4
На основании приведенных результатов культивирования на различных средах и при различных температурах установлено, что наивысший титр клеток достигался к 24 ч выращивания независимо от состава сред. Дальнейшее выращивание и повышение температуры приводило к снижению титра и увеличению количества нежизнеспособных клеток.
Таким образом наиболее экономически выгодной питательной средой, с учетом используемых компонентов, является мелассо-автолизатная среда, при этом температурный оптимум составляет 38 °C, а временной — 24 ч.
Контроль качества пробиотика Трилактокор. Пробиотическая добавка Трилактокор состоит из консорциума трех видов лактобацилл: Lb. salivarius, Lb. intermedius, Lb. agilis. Готовая форма пробиотической добавки Трилактокор состоит из жизнеспособных штаммов лактобактерий и содержит титр не менее 1,0−109 КОЕ/см3 каждой культуры.
Пробиотик представляет собой жидкость темно-коричневого цвета со слабым специфическим запахом питательной среды и с незначительной опалесценцией, которая образована ее компонентами. Производственная среда для бактерий готовится на основе мелассо-автолизатной среды: меласса кормовая — 45,0 г/л; К2НРО4 — 2,0 г/л; дрожжевой автолизат — 10,0 мл/л.
Технологический процесс производства пробиотической добавки Трилактокор включает в себя следующие стадии: получение чистых культур Lb. salivarius, Lb. intermedius и Lb. agilis и их хранение; размножение в лабораторных условиях отдельно чистых культур Lb. salivarius, Lb. intermedius и Lb. agilis на стерильном молоке в течение 1−2 сут. при температуре 37,0−38,0 °С; приготовление засевной культуры данных лактобактерий в колбах; выращивание штаммов в ферментере на мелассо-автолизатной среде; расфасовка и хранение пробиотика.
Качество пробиотической добавки Трилактокор контролируют по органолептическим (цвет, внешний вид, запах), физико-химическим (рН) и биологическим показателям (количество полезной микрофлоры, наличие бактерий группы кишечной палочки, S. aureus, дрожжей и плесеней, токсичность), которые должны соответствовать требованиям и нормам утвержденной технической документации.
Эффективность использования пробиотика Трилактокор на модели экспериментального дисбактериоза у лабораторных животных. Результаты лечебного влияния пробиотика Трилактокор и его отдельных штаммов-пробионтов, представлены в табл. 7.
Установлено, что применение пробиотика позволило повысить содержание лакто- и бифидобактерий, а также снизить уровень условно-патогенной микрофлоры в ЖКТ у мышей, соответственно с 4,43 до 7,14 lg КОЕ/г; с 5,16 до 9,07 lg КОЕ/г; с 7,13 до 3,89 lg КОЕ/г и с 5,18 до 2,98 lg КОЕ/г (P < 0,05). Опытная группа животных, получавших пробиотик Трилактокор по всем изучаемым показателям приближалась к значениям интактной группы.
Результаты профилактического влияния пробиотика Трилактокор и его отдельных штаммов-пробионтов, представлены в табл. 8. Выявлено, что совместное использование антибиотика и физиологического раствора в контрольной группе вызвало снижение полезной микрофлоры, повышение условно-патогенной, а также повышение показателя КМСК с 1,24 до 1,92% для мышей и с 1,35 до 2,01% для крыс. В опытных группах статистически достоверно повышался титр активных молочнокислых и бифидобактерий (P < 0,05), снижалось число микроорганизмов группы кишечной палочки и грибов (P < 0,05), а также наблюдалось снижение показателя КМСК (P < 0,05).
В целом, результаты изучения лечебно-профилактического действия выделенных культур лактобацилл показали, что применение их консорциума в составе пробиотика Трилактокор способствуют положительному клиническому результату, который характеризовался повышением уровня представителей нормофлоры (лакто- и бифидобактерий), а также снижением численности представителей патогенной и условно-патогенной микробиоты, с последующим достижением показателей, характерных для здоровых животных.
Токсикологические исследования кормовой добавки. Токсикологическое действие пробиотика Трилактокор оценивали путем изучения параметров острой, подострой и хронической токсичностей, а также раздражающих характеристик на подопытных лабораторных животных.
В результате проведенных исследований, в течении 14 дней, в остром опыте для изучаемой добавки определить полулетальную дозу (LD50) — не удалось. Все испытуемые живые объекты оставались здоровыми без проявления признаков токсического отравления.
При изучении длительного периода использования пробиотика в составе рационов лабораторных животных, а именно в подостром и хроническом эксперименте, также не было зафиксировано патологии у крыс и мышей. При изучении живой массы животных в опытных группах, где применяли добавку в различных дозах, наблюдалась положительная динамика в приросте. При изучении показателей крови регистрировалось положительное влияние пробиотика на эритро- и гемопоэз, белковый и минеральный обмены.
При изучении раздражающих свойств пробиотика установлено, что во всех экспериментах (кожно-резорбтивная и конъюктивальная пробы) индекс первичного раздражения, согласно ГОСТ Р ИСО 10 993−10−2009, был равен нулю.
Таким образом, пробиотическая добавка Трилактокор безопасна для использования и согласно ГОСТ 12.1.007−76 её можно отнести к 4-му классу опасности.
Влияние пробиотика Трилактокор на организм перепелов. Результаты влияния пробиотика на рост и развитие перепелов представлены в табл. 9.
Таким образом наиболее экономически выгодной питательной средой, с учетом используемых компонентов, является мелассо-автолизатная среда, при этом температурный оптимум составляет 38 °C, а временной — 24 ч.
Контроль качества пробиотика Трилактокор. Пробиотическая добавка Трилактокор состоит из консорциума трех видов лактобацилл: Lb. salivarius, Lb. intermedius, Lb. agilis. Готовая форма пробиотической добавки Трилактокор состоит из жизнеспособных штаммов лактобактерий и содержит титр не менее 1,0−109 КОЕ/см3 каждой культуры.
Пробиотик представляет собой жидкость темно-коричневого цвета со слабым специфическим запахом питательной среды и с незначительной опалесценцией, которая образована ее компонентами. Производственная среда для бактерий готовится на основе мелассо-автолизатной среды: меласса кормовая — 45,0 г/л; К2НРО4 — 2,0 г/л; дрожжевой автолизат — 10,0 мл/л.
Технологический процесс производства пробиотической добавки Трилактокор включает в себя следующие стадии: получение чистых культур Lb. salivarius, Lb. intermedius и Lb. agilis и их хранение; размножение в лабораторных условиях отдельно чистых культур Lb. salivarius, Lb. intermedius и Lb. agilis на стерильном молоке в течение 1−2 сут. при температуре 37,0−38,0 °С; приготовление засевной культуры данных лактобактерий в колбах; выращивание штаммов в ферментере на мелассо-автолизатной среде; расфасовка и хранение пробиотика.
Качество пробиотической добавки Трилактокор контролируют по органолептическим (цвет, внешний вид, запах), физико-химическим (рН) и биологическим показателям (количество полезной микрофлоры, наличие бактерий группы кишечной палочки, S. aureus, дрожжей и плесеней, токсичность), которые должны соответствовать требованиям и нормам утвержденной технической документации.
Эффективность использования пробиотика Трилактокор на модели экспериментального дисбактериоза у лабораторных животных. Результаты лечебного влияния пробиотика Трилактокор и его отдельных штаммов-пробионтов, представлены в табл. 7.
Установлено, что применение пробиотика позволило повысить содержание лакто- и бифидобактерий, а также снизить уровень условно-патогенной микрофлоры в ЖКТ у мышей, соответственно с 4,43 до 7,14 lg КОЕ/г; с 5,16 до 9,07 lg КОЕ/г; с 7,13 до 3,89 lg КОЕ/г и с 5,18 до 2,98 lg КОЕ/г (P < 0,05). Опытная группа животных, получавших пробиотик Трилактокор по всем изучаемым показателям приближалась к значениям интактной группы.
Результаты профилактического влияния пробиотика Трилактокор и его отдельных штаммов-пробионтов, представлены в табл. 8. Выявлено, что совместное использование антибиотика и физиологического раствора в контрольной группе вызвало снижение полезной микрофлоры, повышение условно-патогенной, а также повышение показателя КМСК с 1,24 до 1,92% для мышей и с 1,35 до 2,01% для крыс. В опытных группах статистически достоверно повышался титр активных молочнокислых и бифидобактерий (P < 0,05), снижалось число микроорганизмов группы кишечной палочки и грибов (P < 0,05), а также наблюдалось снижение показателя КМСК (P < 0,05).
В целом, результаты изучения лечебно-профилактического действия выделенных культур лактобацилл показали, что применение их консорциума в составе пробиотика Трилактокор способствуют положительному клиническому результату, который характеризовался повышением уровня представителей нормофлоры (лакто- и бифидобактерий), а также снижением численности представителей патогенной и условно-патогенной микробиоты, с последующим достижением показателей, характерных для здоровых животных.
Токсикологические исследования кормовой добавки. Токсикологическое действие пробиотика Трилактокор оценивали путем изучения параметров острой, подострой и хронической токсичностей, а также раздражающих характеристик на подопытных лабораторных животных.
В результате проведенных исследований, в течении 14 дней, в остром опыте для изучаемой добавки определить полулетальную дозу (LD50) — не удалось. Все испытуемые живые объекты оставались здоровыми без проявления признаков токсического отравления.
При изучении длительного периода использования пробиотика в составе рационов лабораторных животных, а именно в подостром и хроническом эксперименте, также не было зафиксировано патологии у крыс и мышей. При изучении живой массы животных в опытных группах, где применяли добавку в различных дозах, наблюдалась положительная динамика в приросте. При изучении показателей крови регистрировалось положительное влияние пробиотика на эритро- и гемопоэз, белковый и минеральный обмены.
При изучении раздражающих свойств пробиотика установлено, что во всех экспериментах (кожно-резорбтивная и конъюктивальная пробы) индекс первичного раздражения, согласно ГОСТ Р ИСО 10 993−10−2009, был равен нулю.
Таким образом, пробиотическая добавка Трилактокор безопасна для использования и согласно ГОСТ 12.1.007−76 её можно отнести к 4-му классу опасности.
Влияние пробиотика Трилактокор на организм перепелов. Результаты влияния пробиотика на рост и развитие перепелов представлены в табл. 9.
Таблица 7
Таблица 8
Таблица 9
Максимальная сохранность птиц была во 2-й и 4-й опытных группах и составила 99,0%. В 3-й опытной группе — 98,5%, в 1-й — 97,5%. Самая низкая сохранность (95,5%) была в контрольной группе перепелов.
На 56-е сутки была зафиксирована достоверная разница в массе птиц 2−4-й опытных групп в сравнении с контрольной, которая была выше, соответственно, на 6,3; 6,9 и 6,2% (Р < 0,05). Прирост живой массы перепелов в опытных группах превосходил контрольную на: в 1-й — 2,6%; во 2-й — 6,6%; в 3-й — 7,1% и в 4-й — 6,4%. Наименьшее значение конверсии корма было выявлено во 2-й опытной группе — 3,28 кг, что ниже, чем в группе контроля на 1,5%.
Результаты морфо-биохимических показателей крови перепелов представлены в табл. 10.
На 56-е сутки была зафиксирована достоверная разница в массе птиц 2−4-й опытных групп в сравнении с контрольной, которая была выше, соответственно, на 6,3; 6,9 и 6,2% (Р < 0,05). Прирост живой массы перепелов в опытных группах превосходил контрольную на: в 1-й — 2,6%; во 2-й — 6,6%; в 3-й — 7,1% и в 4-й — 6,4%. Наименьшее значение конверсии корма было выявлено во 2-й опытной группе — 3,28 кг, что ниже, чем в группе контроля на 1,5%.
Результаты морфо-биохимических показателей крови перепелов представлены в табл. 10.
Таблица 10
