УДК 632.7
ТЕРЕЩЕНКО Д.С.
КРЫЦЫНА Т.И.
ГРИЗАНОВА Е.В.
ДУБОВСКИЙ И.М.
Новосибирский государственный аграрный университет
КРЫЦЫНА Т.И.
ГРИЗАНОВА Е.В.
ДУБОВСКИЙ И.М.
Новосибирский государственный аграрный университет
Ключевые слова: иммунный ответ, колорадский жук, qPCR, экспрессия генов, бактериоз, энтомопатогенные бактерии, Bacillusthuringiensis
Были подобраны гены-кандидаты, принимающие участие в ответе колорадского жука на развитие бактериального инфекционного процесса.
С помощью Real-time PCR выявлено увеличение уровня экспрессии изучаемых генов при развитии бактериоза Bacillus thuringiensis (БТ) у личинок колорадского жука в кишечнике и жировом теле. При этом было показано, что уровень экспрессии гена С-типа лектинов был увеличен в 10 раз по отношению к контролю в кишечнике при заражении спорами и споро-кристаллической смесью бактерий БТ.
Такая же закономерность наблюдалась и в жировом теле. Анализ уровня экспрессии гена просапосина показал его увеличение в кишечнике при заражении личинок спорами и споро-кристаллической смесью бактерий. В жировом теле отмечено увеличение уровня экспрессии данного гена лишь в варианте с заражением споро-кристаллической смесью бактерий БТ.
Уровень экспрессии гена катепсина увеличивался незначительно в кишечнике во всех вариантах заражения, относительно контроля. Степень активности катепсина была не достоверно выше в жировом теле при использовании споро-кристаллической смеси по отношению к контрольной группе.
Введение.
На сегодняшний день, картофель является незаменимым продуктом питания и дает с единицы площади в 1,5-2,0 раза больше углеводов, чем зерновые культуры. Однако большие потери данной культуры связаны с деятельностью колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata), способного за короткий промежуток времени уничтожать большие площади урожая. Поэтому, для того чтобы получать высокий урожай картофеля, необходимо обеспечивать его защиту от вредителя[2, с. 1–4].
Основным методом борьбы с колорадским жуком являлся химический метод. Однако на сегодняшний день становится всё более предпочтительным использование биопрепаратов, созданных на основе энтомопатогенных микроорганизмов, так как они могут вызывать эпизоотии у насекомых, в частности бактерии группы Bacillus thuringiensis (БТ)[1, с. 8].
В состав биологических препаратов на основе БТ, входят споры и кристаллический дельта-эндотоксин. Считается, что основной вклад в развитие инфекционного процесса при заражении БТ вносит эндотоксин. Под действием щелочного pH кишечника происходит растворение кристалла до протоксина, затем происходит активация токсина под действием сериновых протеаз, после чего истинный токсин связывается с рецепторами на поверхности эпителиальных клеток, что, в результате, приводит к образованию пор в мембране и лизису клетки [3, с. 169, 171].
В настоящее время, синергетическое действие спор изучено слабо, однако, синергизм может наблюдаться между кристаллами и спорами БТ. Несмотря на то, что действие кристалла является ключевым моментом в проявлении токсичности БТ, иногда необходимо присутствие и спор, и кристаллов [3, с. 172].
Цель работы: определить уровень экспрессии генов, принимающих участие в ответе организма колорадского жука при развитии инфекционного процесса, вызванного энтомопатогенным бактериям Bacillus thuringiensis.
На сегодняшний день, картофель является незаменимым продуктом питания и дает с единицы площади в 1,5-2,0 раза больше углеводов, чем зерновые культуры. Однако большие потери данной культуры связаны с деятельностью колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata), способного за короткий промежуток времени уничтожать большие площади урожая. Поэтому, для того чтобы получать высокий урожай картофеля, необходимо обеспечивать его защиту от вредителя[2, с. 1–4].
Основным методом борьбы с колорадским жуком являлся химический метод. Однако на сегодняшний день становится всё более предпочтительным использование биопрепаратов, созданных на основе энтомопатогенных микроорганизмов, так как они могут вызывать эпизоотии у насекомых, в частности бактерии группы Bacillus thuringiensis (БТ)[1, с. 8].
В состав биологических препаратов на основе БТ, входят споры и кристаллический дельта-эндотоксин. Считается, что основной вклад в развитие инфекционного процесса при заражении БТ вносит эндотоксин. Под действием щелочного pH кишечника происходит растворение кристалла до протоксина, затем происходит активация токсина под действием сериновых протеаз, после чего истинный токсин связывается с рецепторами на поверхности эпителиальных клеток, что, в результате, приводит к образованию пор в мембране и лизису клетки [3, с. 169, 171].
В настоящее время, синергетическое действие спор изучено слабо, однако, синергизм может наблюдаться между кристаллами и спорами БТ. Несмотря на то, что действие кристалла является ключевым моментом в проявлении токсичности БТ, иногда необходимо присутствие и спор, и кристаллов [3, с. 172].
Цель работы: определить уровень экспрессии генов, принимающих участие в ответе организма колорадского жука при развитии инфекционного процесса, вызванного энтомопатогенным бактериям Bacillus thuringiensis.
Методика исследований.
Объектом исследования служили личинки колорадского жука Leptinotarsa decemlineata третьего возраста, популяции которых собирали с участков, на которых картофель не подвергался обработке химическими инсектицидами.
Насекомых содержали на базе лаборатории Биологической защиты растений и биотехнологии Новосибирского ГАУ. Для заражения использовали споро-кристаллическую суспензию бактерий Bacillus thuringiensis (БТ) из коллекции лаборатории. Часть жуков содержали на картофеле, листья которого были обработаны спорами БТ, часть насекомых — на листьях, обработанных кристаллическим токсином БТ, а остальных личинок — на листьях со споро-кристаллической смесью БТ.
Контрольная группа содержалась на листве, обработанной физиологическим раствором. Учет смертности проводили ежедневно в течение 7 суток. Скармливание обработанной бактериями листвы проводили однократно. На третьи сутки всю листву заменяли на новую.
Приготовление образцов жирового тела и ткани кишечника для выделения РНК и синтеза кДНК. Перед отбором образцов, поверхность тела подвергали стерилизации 70% этанолом. Далее насекомых препарировали, жировое тело и ткани кишечника помещали в раствор для сохранения РНК при 4 °C. Затем органы извлекали из раствора, замораживали при -80°С и леофилизировали. Разрушение леофилизированных образцов проводили при помощи жидкого азота и пестика. РНК выделяли с использование гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной экстракции (TRIzol). Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически. Выделенную РНК использовали для синтеза кДНК реакцией обратной транскрипцией c помощью набора для синтеза первой цепи кДНК с обратной транскриптазой Maxima H minus (ThermoFisherScientific).
Объектом исследования служили личинки колорадского жука Leptinotarsa decemlineata третьего возраста, популяции которых собирали с участков, на которых картофель не подвергался обработке химическими инсектицидами.
Насекомых содержали на базе лаборатории Биологической защиты растений и биотехнологии Новосибирского ГАУ. Для заражения использовали споро-кристаллическую суспензию бактерий Bacillus thuringiensis (БТ) из коллекции лаборатории. Часть жуков содержали на картофеле, листья которого были обработаны спорами БТ, часть насекомых — на листьях, обработанных кристаллическим токсином БТ, а остальных личинок — на листьях со споро-кристаллической смесью БТ.
Контрольная группа содержалась на листве, обработанной физиологическим раствором. Учет смертности проводили ежедневно в течение 7 суток. Скармливание обработанной бактериями листвы проводили однократно. На третьи сутки всю листву заменяли на новую.
Приготовление образцов жирового тела и ткани кишечника для выделения РНК и синтеза кДНК. Перед отбором образцов, поверхность тела подвергали стерилизации 70% этанолом. Далее насекомых препарировали, жировое тело и ткани кишечника помещали в раствор для сохранения РНК при 4 °C. Затем органы извлекали из раствора, замораживали при -80°С и леофилизировали. Разрушение леофилизированных образцов проводили при помощи жидкого азота и пестика. РНК выделяли с использование гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной экстракции (TRIzol). Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически. Выделенную РНК использовали для синтеза кДНК реакцией обратной транскрипцией c помощью набора для синтеза первой цепи кДНК с обратной транскриптазой Maxima H minus (ThermoFisherScientific).
Оценка уровня экспрессии различных генов в кишечнике и жировом теле насекомых.
Для исследования подбирали гены на базе NCBI, связанные с иммунной системой колорадского жука, а также на основе работ ряда авторов [4, с. 8].
Дизайн праймеров осуществляли на основе опубликованных в NCBI последовательностей для L. Decemlienata и с помощью программы OligoAnalizer Tool.
На основе работы авторов [5, с. 3] были подобраны праймеры для генов домашнего хозяйства.
1) Pr_ RP4_forv 5’-AAAGAAACGAGCATTGCCCTTCCG-3’
Pr_ RP4_rev 5’-TTGTCGCTGACACTGTAGGGTTGA-3
2) Pr_ RP18_forv 5’-TAGAATCCTCAAAGCAGGTGGCGA-3’
Pr_ RP18_rev 5’-AGCTGGACCAAAGTGTTTCACTGC-3’
Были выбраны 3 гена-мишени, кодирующие лектины, катепсины и просапосины. На основе данных генов были подобраны для них нуклеотидные последовательности праймеров (см. таблицу).
Для исследования подбирали гены на базе NCBI, связанные с иммунной системой колорадского жука, а также на основе работ ряда авторов [4, с. 8].
Дизайн праймеров осуществляли на основе опубликованных в NCBI последовательностей для L. Decemlienata и с помощью программы OligoAnalizer Tool.
На основе работы авторов [5, с. 3] были подобраны праймеры для генов домашнего хозяйства.
1) Pr_ RP4_forv 5’-AAAGAAACGAGCATTGCCCTTCCG-3’
Pr_ RP4_rev 5’-TTGTCGCTGACACTGTAGGGTTGA-3
2) Pr_ RP18_forv 5’-TAGAATCCTCAAAGCAGGTGGCGA-3’
Pr_ RP18_rev 5’-AGCTGGACCAAAGTGTTTCACTGC-3’
Были выбраны 3 гена-мишени, кодирующие лектины, катепсины и просапосины. На основе данных генов были подобраны для них нуклеотидные последовательности праймеров (см. таблицу).
Таблица 1
Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 5мкл 2× buf SYBR Blue, 1мкл Prmix и 4 мклкДНК.
Для проведения реакции использовали амплификатор Bio-RadCFX-96 при следующем температурном режиме: начальная денатурация, 95°С – 5 мин; 38 циклов: денатурация, 95°C – 5 с; отжиг, 60°C – 10 с; элонгация, 72°C – 20 с; детекция, 80°C – 5 с.
Все реакции проводили в пяти повторностях, эффективность амплификации и оптимальные пороговые значения Ct рассчитывались по 7 точкам серийных разведений объединенных кДНК. Полученные продукты после ПЦР передавали на секвенирование в ЦКП «Геномика» СО РАН на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. Биоинформатический анализ полученных сиквенсов был выполнен с помощью программы SeqScanner.
Для проведения реакции использовали амплификатор Bio-RadCFX-96 при следующем температурном режиме: начальная денатурация, 95°С – 5 мин; 38 циклов: денатурация, 95°C – 5 с; отжиг, 60°C – 10 с; элонгация, 72°C – 20 с; детекция, 80°C – 5 с.
Все реакции проводили в пяти повторностях, эффективность амплификации и оптимальные пороговые значения Ct рассчитывались по 7 точкам серийных разведений объединенных кДНК. Полученные продукты после ПЦР передавали на секвенирование в ЦКП «Геномика» СО РАН на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. Биоинформатический анализ полученных сиквенсов был выполнен с помощью программы SeqScanner.
Результаты исследований.
Заражение насекомых только спорами приводит к гибели 2% насекомых (рис. 1). Заражение насекомых только токсином вызывало смертность 15% особей на 7-е сутки эксперимента. Заражение спорокристаллической смесью бактерий БТ приводило к синергетическому эффекту в смертности насекомых и 40 % гибели на шестые сутки после заражения (см. рис. 1).
Заражение насекомых только спорами приводит к гибели 2% насекомых (рис. 1). Заражение насекомых только токсином вызывало смертность 15% особей на 7-е сутки эксперимента. Заражение спорокристаллической смесью бактерий БТ приводило к синергетическому эффекту в смертности насекомых и 40 % гибели на шестые сутки после заражения (см. рис. 1).
Рис. 1
Оценка уровня экспрессии генов в кишечнике и жировом теле насекомых
Лектины – тип белков, принимающих участие в клеточном распознавании. Активация экспрессии гена лектина в ответ на инфекцию происходит в исследуемых нами органах насекомых, как в кишечнике, так и в жировом теле (рис. 2, А, Б).
Было обнаружено, что уровень экспрессии данного гена был увеличен до 10 раз по отношению к контролю в кишечнике в вариантах заражения спорами и споро-кристаллической смесью бактерий B. thuringiensis. Уровень экспрессии гена достоверно не отличается между вариантами заражения. Замечено, что такая же закономерность наблюдается в жировом теле.
Лектины – тип белков, принимающих участие в клеточном распознавании. Активация экспрессии гена лектина в ответ на инфекцию происходит в исследуемых нами органах насекомых, как в кишечнике, так и в жировом теле (рис. 2, А, Б).
Было обнаружено, что уровень экспрессии данного гена был увеличен до 10 раз по отношению к контролю в кишечнике в вариантах заражения спорами и споро-кристаллической смесью бактерий B. thuringiensis. Уровень экспрессии гена достоверно не отличается между вариантами заражения. Замечено, что такая же закономерность наблюдается в жировом теле.
Рис. 2
КатепсинБ относится к группе сериновых протеаз, осуществляющих протеолиз белков и принимающих участие в защитных механизмах кишечника. В результате исследования было отмечено, что уровень экспрессии гена Катепсина Б в различных вариантах заражения бактериями незначительно выше в кишечнике, относительно контрольной группы насекомых (рис. 3, А).
Различий между вариантами заражений выявлено не было. При этом наблюдалась тенденция роста уровня экспрессии данного гена в жировом теле в сравнении с кишечником (рис. 3, Б). Уровень экспрессии гена катепсина была не существенно выше в жировом теле насекомого при добавлении споро-кристаллической смеси, по отношению к контролю.
Просапосин – принимает участие в липидном метаболизме. Известно, что при повреждении стенок кишечника бактериями БТ, происходит активизация процессов перекисного окисления липидов, увеличения уровня активированных кислородных метаболитов.
Анализ уровня экспрессии гена просапосина показал его увеличение в кишечнике при заражении колорадского жука спорами и споро-кристаллической смесью бактерий, по сравнению с контрольной группой насекомых (рис. 4, А).
В жировом теле отмечено увеличение уровня экспрессии гена лишь в варианте с заражением споро-кристаллической смесью бактерий БТ, относительно контроля (рис. 4, Б).
Различий между вариантами заражений выявлено не было. При этом наблюдалась тенденция роста уровня экспрессии данного гена в жировом теле в сравнении с кишечником (рис. 3, Б). Уровень экспрессии гена катепсина была не существенно выше в жировом теле насекомого при добавлении споро-кристаллической смеси, по отношению к контролю.
Просапосин – принимает участие в липидном метаболизме. Известно, что при повреждении стенок кишечника бактериями БТ, происходит активизация процессов перекисного окисления липидов, увеличения уровня активированных кислородных метаболитов.
Анализ уровня экспрессии гена просапосина показал его увеличение в кишечнике при заражении колорадского жука спорами и споро-кристаллической смесью бактерий, по сравнению с контрольной группой насекомых (рис. 4, А).
В жировом теле отмечено увеличение уровня экспрессии гена лишь в варианте с заражением споро-кристаллической смесью бактерий БТ, относительно контроля (рис. 4, Б).
Рис. 3
Рис. 4
По результатам исследования можно сделать заключение, что как при совместном, так и раздельном инфицировании спорами и кристаллами B. thuringiensis происходит увеличение уровня экспрессии изучаемых генов (лектина, катепсина и просапосина) у личинок колорадского жука, как в кишечнике, так и жировом теле.
Заключение.
Таким образом, при проникновении спор и/или кристаллического токсина бактерий в организме насекомых происходит распознавание за счет паттерн-распознающих рецепторов (лектины), расположенных на поверхности клеток эпителия кишечника.
Под действием сериновых протеаз (катепсин Б) происходит активация токсина, после чего истинный токсин связывается с рецепторами на поверхности эпителиальных клеток кишечника, что приводит к образованию пор в клетке и её последующей гибели.
В течение этого процесса происходит увеличение процессов ПОЛ, о чем свидетельствует и увеличение уровня экспрессии Просапосина.
Таким образом, организм насекомого комплексно отвечает на развитие бактериальной инфекции, вызванной как раздельным, так и совместным применением спор и кристаллического токсина бактерий B. thuringiensis.
Таким образом, при проникновении спор и/или кристаллического токсина бактерий в организме насекомых происходит распознавание за счет паттерн-распознающих рецепторов (лектины), расположенных на поверхности клеток эпителия кишечника.
Под действием сериновых протеаз (катепсин Б) происходит активация токсина, после чего истинный токсин связывается с рецепторами на поверхности эпителиальных клеток кишечника, что приводит к образованию пор в клетке и её последующей гибели.
В течение этого процесса происходит увеличение процессов ПОЛ, о чем свидетельствует и увеличение уровня экспрессии Просапосина.
Таким образом, организм насекомого комплексно отвечает на развитие бактериальной инфекции, вызванной как раздельным, так и совместным применением спор и кристаллического токсина бактерий B. thuringiensis.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Дубовский И.М. / Эволюция резистентности вощинной огневки Galleriamellonella (L.) к энтомопатогенным бактериям Bacillusthuringiensisи грибам Beauveriabassiana: дис. ... д-ра биол. наук: 03.02.05. // Новосибирск, 2015. – 287 с.
2. Колорадский жук: распространение, экологическая пластичность, вредоносность, методы контроля / В.А. Павлюшин [и др.] // Приложение к журналу «Защита и карантин растений». – 2009. – № 3. – 32с.
3. Штерншис М.В., Андреева И.В., Томилова О.Г. / Биологическая защита растений: учебник. 2-е изд., испр. и доп. – СПб.: Лань, 2018. – 332 с.
4. Kumar A., Congiu L., Lindstr M.L, Sequencing, De Novo assembly and annotation of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata, transcriptome. PLoS One. 2014;9(1): e86012. doi: 10.1371/journal. pone. 86012
5. Shi X-Q, Guo W-C, Wan P-J, Zhou L-T, Ren X-L, Tursun A, Fu K-Y, Li G-Q. 2013. Validation of reference genes for expression analysis by quantitative real-time PCR in Leptinotarsadecemlineata (Say). BMC Res Notes 6:93.
1. Дубовский И.М. / Эволюция резистентности вощинной огневки Galleriamellonella (L.) к энтомопатогенным бактериям Bacillusthuringiensisи грибам Beauveriabassiana: дис. ... д-ра биол. наук: 03.02.05. // Новосибирск, 2015. – 287 с.
2. Колорадский жук: распространение, экологическая пластичность, вредоносность, методы контроля / В.А. Павлюшин [и др.] // Приложение к журналу «Защита и карантин растений». – 2009. – № 3. – 32с.
3. Штерншис М.В., Андреева И.В., Томилова О.Г. / Биологическая защита растений: учебник. 2-е изд., испр. и доп. – СПб.: Лань, 2018. – 332 с.
4. Kumar A., Congiu L., Lindstr M.L, Sequencing, De Novo assembly and annotation of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata, transcriptome. PLoS One. 2014;9(1): e86012. doi: 10.1371/journal. pone. 86012
5. Shi X-Q, Guo W-C, Wan P-J, Zhou L-T, Ren X-L, Tursun A, Fu K-Y, Li G-Q. 2013. Validation of reference genes for expression analysis by quantitative real-time PCR in Leptinotarsadecemlineata (Say). BMC Res Notes 6:93.
STUDYING THE LEVEL OF GENE EXPRESSION USING REAL-TIME PCR IN COLORADO BEETLE LARVAE IN THE DEVELOPMENT OF BACTERIOSIS BACILLUS THURINGIENSIS
Tereshchenko D.S.
Krytsyna T.I.
Grizanova E.V.
Dubovskiy I.M.
Novosibirsk State Agrarian University
Keywords: immune response, Colorado potato beetle, qPCR, gene expression, bacteriosis, entomopathogenic bacteria, Bacillus thuringiensis
Candidate genes were selected to take part in the response of the Colorado potato beetle to the development of a bacterial infection process.
Real-time PCR revealed an increase in the expression level of the studied genes during the development of Bacillus thuringiensis (BT) bacteriosis in Colorado potato beetle larvae in the intestine and adipose body.
It was shown that the level of expression of the C-type lectins gene was increased 10 times in relation to the control in the intestine upon infection with spores and a spore-crystalline mixture of bacteria BT. The same pattern was observed in the fat body.
Analysis of the level of expression of the prosapos in gene showed its increase in the intestine upon infection of the larvae with spores and a spore-crystalline mixture of bacteria. In the fat body, an increase in the level of expression of this gene was noted only in the variant with infection with a spore-crystalline mixture of bacteria BT.
The level of expression of the cathepsin gene increased slightly in the intestine in all infection variants, relative to the control. The degree of cathepsin activity was not significantly higher in the fat body when using a spore-crystalline mixture in relation to the control group.
Krytsyna T.I.
Grizanova E.V.
Dubovskiy I.M.
Novosibirsk State Agrarian University
Keywords: immune response, Colorado potato beetle, qPCR, gene expression, bacteriosis, entomopathogenic bacteria, Bacillus thuringiensis
Candidate genes were selected to take part in the response of the Colorado potato beetle to the development of a bacterial infection process.
Real-time PCR revealed an increase in the expression level of the studied genes during the development of Bacillus thuringiensis (BT) bacteriosis in Colorado potato beetle larvae in the intestine and adipose body.
It was shown that the level of expression of the C-type lectins gene was increased 10 times in relation to the control in the intestine upon infection with spores and a spore-crystalline mixture of bacteria BT. The same pattern was observed in the fat body.
Analysis of the level of expression of the prosapos in gene showed its increase in the intestine upon infection of the larvae with spores and a spore-crystalline mixture of bacteria. In the fat body, an increase in the level of expression of this gene was noted only in the variant with infection with a spore-crystalline mixture of bacteria BT.
The level of expression of the cathepsin gene increased slightly in the intestine in all infection variants, relative to the control. The degree of cathepsin activity was not significantly higher in the fat body when using a spore-crystalline mixture in relation to the control group.