УДК 577.11:577.151
МАЛИШЕВСКИЙ Максим Романович
ТАРАСОВ Сергей Сергеевич
МИХАЛЕВ Евгений Васильевич
Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия
ТАРАСОВ Сергей Сергеевич
МИХАЛЕВ Евгений Васильевич
Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия
Ключевые слова: зеленые корма, органические удобрения, экспрессия генов, супероксиддисмутаза, каталаза, антиоксидантный статус.
Исследование ставит перед собой задачу найти экологически чистое решение данной проблемы, а также более подробно изучить влияние органических удобрений на процесс прорастания и роста побегов растений на примере пшеницы обыкновенной (Triticum vulgare L.).
Введение.
Успешное функционирование и развитие животноводства определяется многими факторами, наиболее значимыми из которых являются кормление, условия содержания и использования животных, их здоровье, генетическая ценность.
Большое значение имеет создание прочной кормовой базы, способной удовлетворить потребности животных в питательных веществах для полной реализации генетического потенциала. Одним из таких методов является способ гидропонного выращивания зеленых кормов [1, c. 45].
Гидропонный зеленый корм (ГЗК) в 6−8 раз дешевле травяной муки, в 5−6 раз — комбикорма и в 3 раза — сена [2, c. 89].
Такой корм содержит требуемые питательные вещества и витамины, хорошо поедается и усваивается всеми сельскохозяйственными животными. Главной проблемой выращивания гидропонного зеленого корма является высокий процент поражаемости плесенью семян проращиваемых культур. Протравители и удобрения, которые уже используются достаточно дороги и не всегда экологически безопасны.
Цель работы: исследовать влияние разных концентраций органического удобрения на проростки пшеницы и кресс-салата проращиваемых методом гидропоники.
Успешное функционирование и развитие животноводства определяется многими факторами, наиболее значимыми из которых являются кормление, условия содержания и использования животных, их здоровье, генетическая ценность.
Большое значение имеет создание прочной кормовой базы, способной удовлетворить потребности животных в питательных веществах для полной реализации генетического потенциала. Одним из таких методов является способ гидропонного выращивания зеленых кормов [1, c. 45].
Гидропонный зеленый корм (ГЗК) в 6−8 раз дешевле травяной муки, в 5−6 раз — комбикорма и в 3 раза — сена [2, c. 89].
Такой корм содержит требуемые питательные вещества и витамины, хорошо поедается и усваивается всеми сельскохозяйственными животными. Главной проблемой выращивания гидропонного зеленого корма является высокий процент поражаемости плесенью семян проращиваемых культур. Протравители и удобрения, которые уже используются достаточно дороги и не всегда экологически безопасны.
Цель работы: исследовать влияние разных концентраций органического удобрения на проростки пшеницы и кресс-салата проращиваемых методом гидропоники.
Методика исследований.
В чашки Петри раскладывали по 50 и 100 семян пшеницы и кресс-салата соответственно. После этого смачивали семена по 10 мл исследуемого раствора [5, c. 27]. В качестве исследуемого раствора использовали органическое удобрение на основе отходов грибоводства в 10%-ой и 100%-й концентрации.
В качестве контрольной пробы применяли водопроводную воду. Проращивали в течение семи суток. Каждый опыт повторяли по 3 раза. Определяли лабораторную всхожесть, показатели прорастания [3, c. 56], активность cупероксиддисмутазы [4, с. 15], каталазы [4, c. 12], экспрессию генов Cu/Zn SOD, Mn SOD, Fe SOD и CAT в прорастающих семенах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
Для этого использовали набор для выделения тотальной РНК (ExtractRNA («Евроген», Россия). кДНК синтезировали, используя набор для обратной транскрипции ОТ-1 с М-MLV обратной транскриптазой и случайными (random) гексапраймерами («Синтол», Россия).
В качестве референсного гена использовался ген актина [Кузнецов, 2011]. Подпор праймеров проводили по кодирующему участку гена в программе Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). Полученные олигонуклеотиды представлены в табл. 1.
В чашки Петри раскладывали по 50 и 100 семян пшеницы и кресс-салата соответственно. После этого смачивали семена по 10 мл исследуемого раствора [5, c. 27]. В качестве исследуемого раствора использовали органическое удобрение на основе отходов грибоводства в 10%-ой и 100%-й концентрации.
В качестве контрольной пробы применяли водопроводную воду. Проращивали в течение семи суток. Каждый опыт повторяли по 3 раза. Определяли лабораторную всхожесть, показатели прорастания [3, c. 56], активность cупероксиддисмутазы [4, с. 15], каталазы [4, c. 12], экспрессию генов Cu/Zn SOD, Mn SOD, Fe SOD и CAT в прорастающих семенах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
Для этого использовали набор для выделения тотальной РНК (ExtractRNA («Евроген», Россия). кДНК синтезировали, используя набор для обратной транскрипции ОТ-1 с М-MLV обратной транскриптазой и случайными (random) гексапраймерами («Синтол», Россия).
В качестве референсного гена использовался ген актина [Кузнецов, 2011]. Подпор праймеров проводили по кодирующему участку гена в программе Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). Полученные олигонуклеотиды представлены в табл. 1.
Таблица 1
Эксперимент проводился в 3 биологических и 3 биохимических повторностях. Результаты обработаны статистически, с расчётом среднее арифметическое (М) и стандартные отклонения () с использованием программы Microsoft Excel 2010 [6, c. 459].
Таблица 2
Таблица 3
Специфическим ферментом, препятствующим повреждающему влиянию супероксиданион- радикала кислородана биологические структуры, является супероксиддисмутаза (СОД), превращающая этот радикал в пероксид водорода. Последний обладает окислительными свойствами, но его реакции с органическими молекулами протекают относительно медленно.
Разработка физиолого-генетических аспектов проблемы свободных радикалов и, в частности, изучение полиморфных белковых и ферментных систем, регулирующих протекание свободно радикальных реакций, может оказаться одним из реальных путей решения физиолого-химических проблем продуктивности.
Исследование активности антиоксидантных ферментов в прорастающих семенах пшеницы показало четкую зависимость от дозы органического удобрения на основе отработанного соломенного субстрата вешенки. На рис. 1 показано, что 10%-й раствор органического удобрения не значительно усиливает активность СОД, а 100% раствор существенно подавляет активность данного фермента.
У суточных семян пшеницы, культивируемых на 100%-м растворе органического удобрения, наблюдается отставание в экспрессии генов Cu/Zn SOD, Mn SOD, Fe SOD, СAT (рис. 3). Уровень транскрипции исследуемых нами генов пшеницы как у суточных прорастающих семян, так и у недельных проростков выращенных на 10%-м органическом удобрении, оказался выше контрольных образцов.
Количество транскриптов иРНК Fe SOD фактически было минимальным и статистически значимо не отличалось во всех исследуемых образцах прорастающих семян на фоне воздействия разными дозами органического удобрения. Слабая реакция и отсутствие, эффекта гена Fe SOD объясняется его локализацией в хлоропластах, которые в суточных проростках ещё не сформированы, а следовательно транскрипция и РНК их генов не имеет смысла.
Разработка физиолого-генетических аспектов проблемы свободных радикалов и, в частности, изучение полиморфных белковых и ферментных систем, регулирующих протекание свободно радикальных реакций, может оказаться одним из реальных путей решения физиолого-химических проблем продуктивности.
Исследование активности антиоксидантных ферментов в прорастающих семенах пшеницы показало четкую зависимость от дозы органического удобрения на основе отработанного соломенного субстрата вешенки. На рис. 1 показано, что 10%-й раствор органического удобрения не значительно усиливает активность СОД, а 100% раствор существенно подавляет активность данного фермента.
У суточных семян пшеницы, культивируемых на 100%-м растворе органического удобрения, наблюдается отставание в экспрессии генов Cu/Zn SOD, Mn SOD, Fe SOD, СAT (рис. 3). Уровень транскрипции исследуемых нами генов пшеницы как у суточных прорастающих семян, так и у недельных проростков выращенных на 10%-м органическом удобрении, оказался выше контрольных образцов.
Количество транскриптов иРНК Fe SOD фактически было минимальным и статистически значимо не отличалось во всех исследуемых образцах прорастающих семян на фоне воздействия разными дозами органического удобрения. Слабая реакция и отсутствие, эффекта гена Fe SOD объясняется его локализацией в хлоропластах, которые в суточных проростках ещё не сформированы, а следовательно транскрипция и РНК их генов не имеет смысла.
Рис. 1
Аналогичная картина наблюдалась и при исследовании активности каталазы в прорастающих семенах пшеницы, однако результаты были более резко выраженными (Рис. 2)
Рис. 2
Рис. 3
Положительное влияние 10%-го раствора органического удобрения наблюдается как в измерениях активности cупероксиддисмутазы и каталазы, так и в экспрессии генов Cu/Zn SOD, Mn SOD, Fe SOD и САТ в прорастающих семенах пшеницы. 100%-й раствор замедляет метаболизм прорастающих семян.
Заключение.
По исследуемым признакам исследуемое органическое удобрение показала положительный эффект только при 10 %-й концентрации, в 100%-й концентрации наблюдался ростингибирующий эффект.
Проведенные опыты и теоритические исследования по вопросу создания субстратов для гидропонного выращивания сельскохозяйственных растений из отходов АПК, дают основу для проведения дальнейших исследований по изучению и внедрению данного приема, как один из методов защиты с.-х. растений.
По исследуемым признакам исследуемое органическое удобрение показала положительный эффект только при 10 %-й концентрации, в 100%-й концентрации наблюдался ростингибирующий эффект.
Проведенные опыты и теоритические исследования по вопросу создания субстратов для гидропонного выращивания сельскохозяйственных растений из отходов АПК, дают основу для проведения дальнейших исследований по изучению и внедрению данного приема, как один из методов защиты с.-х. растений.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бакай С. М., Гетя Н. В. / Изучение технологии выращивания зеленых кормов гидропонным методом // Свиноводство. — 1970. — № 11. — С. 67−68.
2. Кругляков Ю. А. / Оборудование для непрерывного выращивания зеленого корма гидропонным способом. // М.: ВО Агропромиздат, 1991. — 79 с.
3. Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной биологии растений / под ред. Вл.В. Кузнецова, В. В. Кузнецова, Г. А. Романова. // М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. — 487 с.
4. Методика определения силы роста семян кормовых культур / В. И. Карпин [и др.]. // М.: Изд-во РГАУ- МСХА, 2012. — 16 с.
5. Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений: учеб.-метод. пособие / Г. В. Сибгатуллина [и др.]. // Казань: Казанский (Приволжский) Федеральный университет, 2011. — 61 с.
6. Гриценко В. В., Дмитриева В. А., Бугаев П. Д. / Совершенствование методики проращивания семян при определении всхожести // Селекция и семеноводство. — 1987. — № 2. — С. 42−43.
7. Гланц С. / Медико-биологическая статистика. — М.: Практика, 1999. — 459 с.
1. Бакай С. М., Гетя Н. В. / Изучение технологии выращивания зеленых кормов гидропонным методом // Свиноводство. — 1970. — № 11. — С. 67−68.
2. Кругляков Ю. А. / Оборудование для непрерывного выращивания зеленого корма гидропонным способом. // М.: ВО Агропромиздат, 1991. — 79 с.
3. Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной биологии растений / под ред. Вл.В. Кузнецова, В. В. Кузнецова, Г. А. Романова. // М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. — 487 с.
4. Методика определения силы роста семян кормовых культур / В. И. Карпин [и др.]. // М.: Изд-во РГАУ- МСХА, 2012. — 16 с.
5. Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений: учеб.-метод. пособие / Г. В. Сибгатуллина [и др.]. // Казань: Казанский (Приволжский) Федеральный университет, 2011. — 61 с.
6. Гриценко В. В., Дмитриева В. А., Бугаев П. Д. / Совершенствование методики проращивания семян при определении всхожести // Селекция и семеноводство. — 1987. — № 2. — С. 42−43.
7. Гланц С. / Медико-биологическая статистика. — М.: Практика, 1999. — 459 с.
PRODUCTION AND RESEARCH OF HYDROPONIC FEEDS AND MICRO-GREEN ON THE BASIS OF ECOLOGICALLY PURE ORGANIC FERTILIZER
Malishevsky M.R. Tarasov S.S. Mikhalev E.V.
Nizhny Novgorod State Agricultural Academy
Keywords: green food, complex fertilizers, gene expression, photosynthetic pigments, antioxidant status.
The purpose of this study is to find an environmentally safe solution to this problem, as well as a more detailed study of the effect of organic fertilizers on the process of germination and growth of plant shoots on the example of common wheat (Triticum vulgare L.).
Nizhny Novgorod State Agricultural Academy
Keywords: green food, complex fertilizers, gene expression, photosynthetic pigments, antioxidant status.
The purpose of this study is to find an environmentally safe solution to this problem, as well as a more detailed study of the effect of organic fertilizers on the process of germination and growth of plant shoots on the example of common wheat (Triticum vulgare L.).