Активность детоксицирующих и пищеварительных ферментов у пчел apis mellifera при внесении в подкормку штаммов bacillus с пробиотическими свойствами

СОКОЛОВА Э.С. (1)
ГРИЗАНОВА Е.В. (1)
МАГЕР С.Н. (2)
ДУБОВСКИЙ И.М. (1,2)

1. Новосибирский государственный аграрный университет
2. Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук

Введение.

В#nbsp;ранневесенний период, при скудном взятке, а#nbsp;также во#nbsp;время зимовки, когда условия среды становятся неблагоприятными для#nbsp;жизнедеятельности пчел, они наиболее подвержены воздействию различных патогенных факторов. Для#nbsp;обеспечения пчел необходимым количеством питательных веществ и#nbsp;активизации обменных процессов в#nbsp;эти периоды пчеловоды применяют различные подкормки. Они позволяют как нарастить силу семьи и#nbsp;увеличить выход товарного меда, так и#nbsp;поддержать защитные системы пчел для#nbsp;повышения их#nbsp;резистентности к#nbsp;различным инфекционным, вирусным и#nbsp;паразитарным заболеваниям [2, c. 192]

В#nbsp;частности, в#nbsp;последние годы регистрируется все больше случаев синдрома разрушения пчелиных семей, одной из#nbsp;возможных причин которого является снижение жизнеспособности пчел под воздействием экологических факторов (таких, как применение пестицидов [14, c.105]) и#nbsp;климатических изменений [22, c. 345]. Разрушение колоний наносит серьезный урон не#nbsp;только производству меда, но#nbsp;и#nbsp;опылению растений, поэтому это явление сильно беспокоит ученых и#nbsp;мировую общественность.

Для#nbsp;профилактики и#nbsp;лечения пчел от#nbsp;инфекций и#nbsp;паразитозов (таких как варроатоз, акарипидоз) пчеловоды, как правило, прибегают к#nbsp;использованию различных антибиотиков и#nbsp;инсектицидов, что накладывает ограничения на#nbsp;производство органического меда и#nbsp;других продуктов пчеловодства. Поэтому, с#nbsp;целью поиска эффективных и#nbsp;безопасных способов предотвратить ослабление и#nbsp;гибель пчелиных семей, необходимо сделать упор на#nbsp;стимуляцию естественных физиологических процессов в#nbsp;организме пчел, активируя их#nbsp;собственные механизмы резистентности.

Пробиотические бактерии не#nbsp;только выступают в#nbsp;кишечнике пчелы как антагонисты условно- патогенной микрофлоры, но#nbsp;и#nbsp;являются постоянным источником высокоусваиваемого белка. Это особенно важно во#nbsp;время интенсивного наращивания расплода#nbsp;— чувствительность взрослых пчел к#nbsp;пестицидам напрямую зависит от#nbsp;количества и#nbsp;качества протеина, потребляемого в#nbsp;первые 10 дней после вылупления [26, c. 121.], особенно при влиянии других стрессовых факторов (например, низких температур [7, c. 921]).

Bacillus subtilis и#nbsp;Bacillus licheniformis#nbsp;— это родственные виды грамположительных бактерий. Являясь антагонистами патогенных и#nbsp;условно-патогенных микроорганизмов (стафилококк, стрептококк, сальмонелла), они стимулируют рост нормальной микрофлоры кишечника. Размножаясь в#nbsp;просвете кишечника, эти бактерии вырабатывают все основные пищеварительные ферменты (протеазы, амилазы, липазы, пектиназы, целлюлазы), которые оказывают антимикробное и#nbsp;антитоксическое действие, а#nbsp;также стимулируют обменные процессы в#nbsp;макроорганизме [25, c. 850].

Bacillus. subtilis#nbsp;— вид грамположительных спорообразующих аэробных почвенных бактерий. Он#nbsp;является одним из#nbsp;наиболее перспективных пробиотиков, изученных в#nbsp;последние десятилетия. Механизмы пробиотического действия связаны с#nbsp;синтезом противомикробных веществ, усилением неспецифического и#nbsp;специфического иммунитета, стимуляцией роста нормальной микрофлоры кишечника и#nbsp;выделением пищеварительных ферментов.

B. subtilis выделяет рибосомально синтезируемые пептиды, нерибосомально синтезируемые пептиды и#nbsp;непептидные вещества с#nbsp;широким спектром противомикробной активности, охватывающим грамположительные, грамотрицательные бактерии, вирусы и#nbsp;грибы [9, c. 267].

Резистентность к#nbsp;данным противомикробным веществам возникает редко. Кроме того, пробиотик увеличивает разнообразие микрофлоры кишечника [16, c. 1131]. Было установлено, что B. subtilis синтезирует ряд витаминов, в#nbsp;частности В1, В6 и#nbsp;менахинон (К2) [12, c. 6468; 23, c. 309; 17, c. 219]. Разные штаммы B. subtilis выделяют разный набор аминокислот, некоторые из#nbsp;которых являются незаменимыми, например валин [5, c. 869].

Bacillus licheniformis#nbsp;— грамположительные, мезофильные бактерии, подвижные, факультативные анаэробы (в#nbsp;отличие от#nbsp;других микобактерий, которые обычно аэробные) и#nbsp;тесно связаны с#nbsp;Bacillus subtilis. Bacillus licheniformis#nbsp;— одна из#nbsp;самых важных бактерий в#nbsp;производстве промышленных ферментов, обладает большими объемами секреции щелочной сериновой протеазы, альфа амилазы [3, с. 32].

Функция детоксицирующей системы насекомых#nbsp;— это преобразование эндогенных и#nbsp;экзогенных токсичных веществ в#nbsp;менее ядовитые. Реакции биотрансформации разделяют на#nbsp;две фазы. Реакции фазы 1 включают окислительные, восстановительные и#nbsp;гидролитические реакции.

В#nbsp;результате ферментативных реакций фазы 1 образуются водорастворимые соединения. Реакции фазы 2#nbsp;— это процессы биосинтетической конъюгации, где ферменты этой фазы связываются с#nbsp;продуктами фазы 1, после чего данные вещества подвергаются восстановлению или гидролизу, с#nbsp;последующим выведением из#nbsp;организма [20, с. 39].

У#nbsp;насекомых описаны три основные ферментативные группы, участвующие в#nbsp;детоксикации и#nbsp;инактивации токсичных веществ. Это цитохром Р450 (монооксигеназы), участвующие в#nbsp;окислительных реакциях фазы 1, эстеразы#nbsp;— участвующие в#nbsp;гидролизе (деэтерификация) фазы 1 [19, c. 238], глутатион-Э-трансферазы (ГСТ)#nbsp;— в#nbsp;гидролизе фазы 2 [18, c. 741].

Глутатион-S-трансферазы обеспечивают взаимодействие различных веществ с#nbsp;восстановленным глутатионом. В#nbsp;организме насекомых выделяют две группы данных ферментов: микросомальные и#nbsp;цитозольные глутатион-S-транферазы. ГСТ играют важную роль в#nbsp;обезвреживании вторичных метаболитов и#nbsp;инсектицидов, а#nbsp;также защищает от#nbsp;перекисных липидов (но#nbsp;не#nbsp;H2O2) [13, c. 5]. При реакции восстановленного глутатиона с#nbsp;перекисью жирной кислоты происходит восстановление окисленной группы до#nbsp;спирта и#nbsp;воды [1, c. 191].

Неспецифические эстеразы#nbsp;— неоднородная группа ферментов, отличающихся друг от#nbsp;друга по#nbsp;субстратной специфичности и#nbsp;действию активаторов и#nbsp;ингибиторов. Все неспецифические эстеразы являются лизосомальными ферментами. Ферменты получили название от#nbsp;субстратов, которые они гидролизуют, и#nbsp;от#nbsp;реакции среды, где они проявляют свое действие [1, c. 318].

Целью наших исследований было изучение активности детоксицирующей и#nbsp;пищеварительной систем рабочих пчел при добавлении в#nbsp;подкормку бактерий вышеуказанных штаммов как вместе, так и#nbsp;по#nbsp;отдельности. Для#nbsp;этого был проведен анализ активности ферментов глутатион-S-транфераз (ГСТ) и#nbsp;неспецифических эстераз в#nbsp;мышечной ткани и#nbsp;кишечнике имаго, а#nbsp;также измерение уровня активности протеолитических ферментов кишечника.

Методика исследований.

Объектом исследований служили пчелы Apis mellifera, собранные на#nbsp;учебно-производственной пасеке СФНЦА РАН в#nbsp;Новосибирской области в#nbsp;июне 2019#nbsp;г.

В#nbsp;лаборатории насекомых усыпляли углекислым газом и#nbsp;по#nbsp;визуальным признакам отбирали рабочих пчел для#nbsp;закладки эксперимента. Насекомых содержали при 28#nbsp;°C, в#nbsp;прозрачных пластиковых контейнерах со#nbsp;свободным доступом к#nbsp;воде и#nbsp;40% сахарному раствору.

При тестировании пробиотических добавок (Bacillus subtilis и#nbsp;Bacillus licheniformis), бактерии добавляли в#nbsp;сахарный сироп в#nbsp;количестве 1#nbsp;г лиофилизата на#nbsp;литр подкормки. Воду и#nbsp;сироп заменяли ежедневно в#nbsp;течение 10 дней, после чего от#nbsp;каждого варианта для#nbsp;определения активности ферментов и#nbsp;концентрации белка было отобрано по#nbsp;20 пчел.

Выделение ткани кишечника и#nbsp;летательных мышц производили в#nbsp;физиологическом растворе (0,9% NaCl). Извлеченные органы гомогенизировали в#nbsp;100 мкл 0,1#nbsp;М Na-фосфатного буфера pH#nbsp;7,2 (ФБ) с#nbsp;помощью ультразвукового гомогенизатора. Полученные гомогенаты центрифугировали при 4#nbsp;°C в#nbsp;течение 15 мин при 10 000#nbsp;g. Надосадочную жидкость использовали для#nbsp;определения активности ферментов и#nbsp;концентрации белка.

Активность глутатион-S-трансферазы (ГСТ) определяли спектрофотометрически при 340 нм#nbsp;по#nbsp;скорости увеличения концентрации 5-(2,4-динитрофенил)-глутатиона, продукта реакции динитробензола (ДНБ) и#nbsp;восстановленного глутатиона, катализируемой ГСТ [12, c. 7135]. Инкубацию проводили при 28#nbsp;°C в#nbsp;течение 5 мин в#nbsp;205 мкл 10#nbsp;мМ фосфатном буфере pH#nbsp;7.2 с#nbsp;150#nbsp;мМ NaCl (ФБ), содержащем 1#nbsp;мМ глутатиона, 1#nbsp;мМ ДНБ и#nbsp;образец 5 мкл гомогената ткани. Удельную активность фермента выражали в#nbsp;единицах изменения оптической плотности инкубационной смеси при 340 нм#nbsp;в#nbsp;ходе реакции в#nbsp;расчете на#nbsp;1 минуту и#nbsp;1#nbsp;мг белка.

Спектрофотометрическое определение активности эстераз в#nbsp;гомогенатах кишечника и#nbsp;мышц проводили по К. Асперену [8, c. 406] с#nbsp;незначительными изменениями. Инкубационная смесь содержала 200 мкл 0.54 мМ#nbsp;1-нафтилацетата в#nbsp;фосфатном буфере (ФБ) и#nbsp;образец 5 мкл гомогената ткани. Полученную смесь инкубировали в#nbsp;темноте в#nbsp;течение 5 мин при 28#nbsp;°C. Оптическую плотность измеряли при длине волны 410#nbsp;нм. Удельную активность фермента выражали в#nbsp;единицах изменения оптической плотности инкубационной смеси при 410 нм#nbsp;в#nbsp;ходе реакции в#nbsp;расчете на#nbsp;1 минуту и#nbsp;1#nbsp;мг белка.

Общую протеолитическую активность определяли по#nbsp;скорости гидролиза 0,3% азоказеина в#nbsp;ФБ спектрофотометрически при 440 нм#nbsp;по#nbsp;Аларкону и#nbsp;др. [6, c. 270] с#nbsp;незначительными изменениями. К#nbsp;210 мкл реакционной смеси (0,3% азоказеин в#nbsp;ФБ) добавляли 30 мкл образца и#nbsp;инкубировали при 37#nbsp;°C в#nbsp;термостате в#nbsp;течение 24 часов. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл раствора ТХУ (30%). Полученную смесь инкубировали при -18°С в#nbsp;течение 30 мин, затем центрифугировали при 4#nbsp;°C в#nbsp;течение 10 мин при 10000g. К#nbsp;150 мкл супернатанта добавляли 70 мкл 1#nbsp;М NaOH.

Концентрацию белка в#nbsp;гомогенатах кишечника определяли по#nbsp;методу Бредфорда [10, c. 248−254]. Для#nbsp;построения калибровочной кривой использовали бычий сывороточный альбумин (БСА).

Полученные данные обрабатывали статистически, рассчитывая среднее арифметическое и#nbsp;его ошибку. Для#nbsp;проверки нормальности распределения данных использовали W#nbsp;критерий Шапиро-Уилка. Статистическую значимость различий изучаемых параметров с#nbsp;нормальным распределением определяли с#nbsp;однофакторного дисперсионного анализа с#nbsp;последующим тестом (Dunnet test) (Prism 8).

Результаты исследований.

В результате исследования было установлено достоверное снижение активности неспецифических эстераз (p<0.05) и ГСТ (p<0.0001) в кишечнике пчел при внесении в подкормку бактерий B. licheniformis (рис. 1, 2). Вероятно, это связано со снижением уровня токсинов в пищеварительной системе насекомых при питании кормом с добавлением бактерий B. licheniformis.

Также отмечено достоверное увеличение активности неспецифических эстераз в кишечнике (p<0.05) при внесении в подкормку смеси бактерий B.subtilis и B. licheniformis (рис. 1). Механизм подобного увеличения требует дальнейшего изучения и может быть связан с эстеразами, выделяемыми непосредственно прокариотическими организмами [24, с. 242].

Также зафиксировано увеличение общей протеолитической активности в кишечнике в 1,2 раза (p<0.05) при скармливании B. licheniformis (рис. 3). Активность этих ферментов напрямую связана с процессами переваривания и всасывания питательных веществ в кишечнике пчел [11, c. 285], что говорит об увеличении пищеварительной активности пчел при внесении B. licheniforumis в подкормку.

В крыловых мышцах установлено достоверное увеличение активности неспецифических эстераз и ГСТ при внесении смеси бактерий B. subtilis и B. licheniformis (рис. 4, 5). Это может быть связано с увеличением двигательной активности пчел [21, c. 555].

Заключение.

Таким образом, положительное влияние пробиотических штаммов Bacillus spp. на пищеварительную и детоксицирующую систему пчел Apis Mellifera в лабораторных условиях подтверждает необходимость разработки наиболее рациональных способов применения исследованных штаммов в пчеловодстве, а также тестирования их в естественных условиях пасеки.

Следует отметить, что изучение активности эстераз в грудных мышцах пчел проведено впервые. Зафиксированное увеличение активности эстераз и ГСТ у имаго пчел в мышцах после скармливания кормовой добавки может повлиять на эффективность борьбы с ксенобиотиками и ускорить процессы расщепления сложных эфиров.

Авторы благодарны к.б.н. Галине Васильевне Калмыковой и Надежде Ивановне Акуловой за предо- ставленные лиофилизаты бактерий.

Исследование выполнено при поддержке проекта № 0533-2019-0003.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Зенков#nbsp;Н.#nbsp;К., Ланкин#nbsp;В.#nbsp;З., Меньщикова#nbsp;Е.#nbsp;Б. / Окислительный стресс: Биохимический и#nbsp;патофизиологический аспекты. // М.: МАИК Наука Интерпериодика, 2001. —#nbsp;343 с.

2. Кривцов#nbsp;Н.#nbsp;И., Лебедев#nbsp;В.#nbsp;И., Туников#nbsp;Г.#nbsp;М. / Пчеловодство. // М.: Колос, 2007. —#nbsp;С. 180−193.

3. Похиленко#nbsp;В.#nbsp;Д., Перелыгин#nbsp;В.#nbsp;В. / Пробиотики на#nbsp;основе спорообразующих бактерий и#nbsp;их#nbsp;безопасность // Химическая и#nbsp;биологическая безопасность. —#nbsp;2007. —#nbsp;№ 2. —#nbsp;С. 32−33.

4. Савустьяненко#nbsp;А.#nbsp;В. / Механизмы действия пробиотиков на#nbsp;основе B. subtilis. // Актуальная инфектология. —#nbsp;2016. —#nbsp;№ 2(11). —#nbsp;С. 35−38.

5. Спорообразующие аэробные бактерии#nbsp;— продуценты биологически-активных веществ / В.#nbsp;В.#nbsp;Смирнов [и др.] // Микробиология. —#nbsp;1992. —#nbsp;№ 5. —#nbsp;С. 865−872.

6. Alarcon F.J., Martinez T.F., Barranco P., Cabello T., Diaz M., Moyano F.J. / 2002. Digestive proteases during development of#nbsp;larvae of#nbsp;red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Oliver, 1790) (Coleoptera: Curculionidae) // Insect Biochemistry and Molecular Biology. № 32. P.265−274.

7. Archer CR, Pirk CWW, Wright GA, Nicolson#nbsp;SW: Nutrition affects survival in#nbsp;African honeybees exposed to#nbsp;interacting stressors. Functional Ecology 2014, 28(4): 913−923.

8. Asperen K., Van. A. / Study of#nbsp;housefly esterase by#nbsp;means of#nbsp;a#nbsp;sensitive colorimetric method // J. Insect Physiol. 1962. V. 8. P. 401−416.

9. Awasis M. / Production of#nbsp;Antimicrobial Metabolites by#nbsp;Bacillus subtilis Immobilized in#nbsp;Polyacrylamide Gel / Awais M, Pervez, A., Yaqub Asim, Shah M.M. //Pakistan J. Zool. —#nbsp;2010. —#nbsp;Vol. 42, № 3. —#nbsp;P. 267−275.

10. Bradford M.M. / 1976. A#nbsp;rapid and sensitive method for the quantitation of#nbsp;microgram quantities of#nbsp;protein utilizing the principle of#nbsp;protein dye binding. // Anal. Biochem. Vol. 72. P.248−254.

11. Brodschneider R, Crailsheim K (2010): Nutrition and health in#nbsp;honey bees. Apidologie 41, 278−294

12. Chiu H.J. et#nbsp;al. Crystal structure of#nbsp;thiamin phosphate synthase from Bacillus subtilis at#nbsp;1.25 A#nbsp;resolution / Chiu H.J., Reddick J.J., Begley T. P, Ealick S.E. //Biochemistry. —#nbsp;1999. —#nbsp;Vol. 38, № 20. —#nbsp;P. 6460−6470.

13. Enayati AA, Ranson H, Hemingway J (2005) Insect glutathione transferases and insecticide resistance. Insect Mol Biol 14(1): 3−8

14. Gill RJ, Ramos-Rodriguez O, and Raine#nbsp;NE. / 2012. Combined pesticide exposure severely affects individual- and colony-level traits in#nbsp;bees. Nature 491: 105- 108.

15. Habig W.H., Pabst M.J., Jakoby W.B. / 1974. Glutathione-S-transferases // J. Biol. Chem. Vol.249. P.7130−7139.

16. Hu#nbsp;Y#nbsp;et al. / Effects of#nbsp;Bacillus subtilis KN-42 on#nbsp;Growth Performance, Diarrhea and Faecal Bacterial Flora of#nbsp;Weaned Piglets / Hu Y, Dun Y, Li S. et#nbsp;al. // Asian-Australas J. Anim. Sci. —#nbsp;2014. —#nbsp;Vol. 27, № 8. —#nbsp;P. 1131−1140.

17. Ikeda H., Doi Y. A#nbsp;vitamin-K2-binding factor secreted from Bacillus subtilis // Eur. J. Biochem. —#nbsp;1990. —#nbsp;Vol. 192, № 1. -P. 219−224

18. Labrou, N.E.; Kotzia, G.A.; Clonis, Y.D. / Engineering the xenobiotic substrate specificity of#nbsp;maize glutathione S-transferase I. Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, c. 741.

19. Li X., Schuler M.A., Berenbaum M.R. / Molecular mechanisms of#nbsp;metabolic resistance to#nbsp;synthetic and natural xenobiotics // Annu. Rev. Entomol. 2007. Vol. 52. P. 231−253.

20. Mamidala P, Jones SC, Mittapalli O. / Metabolic Resistance in#nbsp;Bed Bugs. Insects. 2011; 2(1):36−48.

21. Parco M. Siu et#nbsp;al. / Citrate synthase expression and enzyme activity after endurance training in#nbsp;cardiac and skeletal muscles //Parco M. Siu, David A. Donley, Randall W. Bryner, Stephen E. Always // J#nbsp;Appl Physiol 94: 555- 560, 2003. P. 555.

22. Potts, S. G. et#nbsp;al. / Global pollinator declines: trends, impacts and drivers. Trends Ecol. Evol. 2010, 25, 345−353.

23. Sakai A. et#nbsp;al. YaaD and yaaE are involved in#nbsp;vitamin B6 biosynthesis in#nbsp;Bacillus subtilis / Sakai A., Kita M., Katsuragi T. et#nbsp;al. // J. Biosci. Bioeng. 2002. Vol. 93. № 3. P. 309−312.

24. Sierra, G. / Studies on#nbsp;bacterial esterases. Antonie van Leeuwenhoek 23. 1957. P. 241−265.

25. Stein T. / Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions // Mol. Microbiol. 2005. Vol. 56. № 4. P. 845−857.

26. Wahl O, Ulm K. / Influence of#nbsp;pollen feeding and physiological condition on#nbsp;pesticide sensitivity of#nbsp;the honey bee Apis mellifera carnica. Oecologia 1983, 59, 106−128.

Sokolova E.S. (1), Grizanova E.V. (1), Mager S.N. (2), Dubovsky I.M. (1,2)

1) Novosibirsk State Agrarian University, Laboratory of Biological Plant Protection and Biotechnology
2) Siberian Federal Scientific Centre of Agro-BioTechnol- ogies of the Russian Academy of Sciences

Keywords: beekeeping, probiotics, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, honey bee, Apis mellifera.

Effects of Bacillus subtillis and Bacillus lichen- formis bacteria used as probiotics on digestive and detoxification enzyme activity in the honeybee Apis mellifera were evaluated. Worker bees were picked on the apiarea and randomly allocated into four equally groups. Bees of group 1 (control group) were fed for 10 days with syrup that did not supplemented with probiotic. The bees of groups 2, 3, and 4 were fed with syrup supplemented with 1g of B. subtilis, 1 g B. licheniformis and 1 g mixed B. subtilis and B. licheniformis per 1 liter of syrup, respectively.

The results of the current study revealed that bees fed a syrup containing B. licheniformis showed a decrease in the 1 activity of non-specific esterases and glutathione-S- transferases in the intestine, as well as a 1.2-fold increase in proteolytic activity. Also, the addition of B. 2019 subtilis and B. licheniformis increased the activity of esterases and GST in the muscles of imago bees.