УДК 632.9
ХУДЫШКИНА В.С.
Новосибирский государственный аграрный университет
Новосибирский государственный аграрный университет
Ключевые слова: вощинная огневка Galleria Mellonella, грибная инфекция Metarhizium brunneum, 20-гидроксиэкдизона, иммунный ответ.
Статья посвящена исследованию влияния 20-гидроксиэкдизона и его модифицированного гормона на организм насекомого при развитии грибной инфекции.
Показано, что скармливание гормона приводит к снижению интенсивности инкапсуляции и увеличению чувствительности насекомых к грибному патогену M. brunneum.
Введение.
Биологические препараты являются экологически безопасной альтернативой химическим пестицидам при защите растений от вредителей. Они создаются на основе природных микроорганизмов, которые обладают относительно высокой специфичностью действия.
Отличительной особенностью энтомопатогенных грибов от энтомопатогенов бактериальной или вирусной природы является их способность проникать в организмы насекомых не только перорально, но и через кутикулу.
Процесс инфицирования и последующего развития зависит как от факторов вирулентности самого гриба, так и от насекомого и его защитных механизмов. При попадании спор гриба на кутикулу насекомых, начинают работать внешние защитные механизмы насекомого. Споры гриба фиксируются на гидрофобной поверхности кутикулы насекомого, и начинают свое развитие, затем проникают и развиваются внутри кутикулярного барьера, и далее проходят в полость тела и поражают внутренние органы. Важно отметить, что в процессе фиксации спор гриба на кутикулярном покрове, большую роль играет необходимая влажность окружающей среды, для дальнейшего прорастания и развития гриба [1, 4].
Защитные механизмы насекомых условно разделяют на внешние и внутренние [1]. Внешняя защита включает в себя кутикулярный барьер, железы внешней секреции и кишечник, который выстлан хитиновой интимой. Внутренняя защита включает клеточный и гуморальный иммунитет, биохимические реакции и ряд других защитных механизмов. Инкапсуляция – это иммунная защитная реакция, направленная на изоляцию чужеродного агента, проникающего или проникшего в гемоцель, за счет создания плотной меланизированной капсулы.
Кроме того, этот процесс ограничивает повреждение кутикулы, которые вызваны патогеном и предотвращают рост и распространение болезнетворного микроорганизма. И именно поэтому, является одной из основных защитных реакций насекомых против проникших в гемоцель чужеродных агентов. Кроме того, толщина кутикулы, реакция инкапсуляция и меланизация – являются ключевыми защитными реакциями насекомых, способными остановить развитие грибной инфекции [3, 5].
Экдизон – это гормон насекомых, обусловливающий наступление и прохождение линьки, а также склеротизацию покровов. Продуцируются проторакальными железами. Процесс линьки – смены кутикулярного покрова - является наиболее уязвимым моментом для насекомого, гриб и любой другой патоген легко может проникнуть через тонкие, еще не склеротизированные покровы [4, 6].
Усовершенствование существующих и создание новых биопрепаратов становиться все более актуальным в связи с недавно принятым законом об Органическом земледелии, где возможно применение только биологических и экологически чистых препаратов. Таким образом, становится актуальным поиск различных биологических добавок, снижающих активность защитных систем насекомых и изучение их влияния на восприимчивость насекомых к энтомопатогенам.
Цель исследования – изучить влияние синтетического экдизона и его модификанта на иммунный ответ личинок большой вощинной огневки Galleria mellonella и чувствительность к грибной инфекции Metarhizium brunneum.
Биологические препараты являются экологически безопасной альтернативой химическим пестицидам при защите растений от вредителей. Они создаются на основе природных микроорганизмов, которые обладают относительно высокой специфичностью действия.
Отличительной особенностью энтомопатогенных грибов от энтомопатогенов бактериальной или вирусной природы является их способность проникать в организмы насекомых не только перорально, но и через кутикулу.
Процесс инфицирования и последующего развития зависит как от факторов вирулентности самого гриба, так и от насекомого и его защитных механизмов. При попадании спор гриба на кутикулу насекомых, начинают работать внешние защитные механизмы насекомого. Споры гриба фиксируются на гидрофобной поверхности кутикулы насекомого, и начинают свое развитие, затем проникают и развиваются внутри кутикулярного барьера, и далее проходят в полость тела и поражают внутренние органы. Важно отметить, что в процессе фиксации спор гриба на кутикулярном покрове, большую роль играет необходимая влажность окружающей среды, для дальнейшего прорастания и развития гриба [1, 4].
Защитные механизмы насекомых условно разделяют на внешние и внутренние [1]. Внешняя защита включает в себя кутикулярный барьер, железы внешней секреции и кишечник, который выстлан хитиновой интимой. Внутренняя защита включает клеточный и гуморальный иммунитет, биохимические реакции и ряд других защитных механизмов. Инкапсуляция – это иммунная защитная реакция, направленная на изоляцию чужеродного агента, проникающего или проникшего в гемоцель, за счет создания плотной меланизированной капсулы.
Кроме того, этот процесс ограничивает повреждение кутикулы, которые вызваны патогеном и предотвращают рост и распространение болезнетворного микроорганизма. И именно поэтому, является одной из основных защитных реакций насекомых против проникших в гемоцель чужеродных агентов. Кроме того, толщина кутикулы, реакция инкапсуляция и меланизация – являются ключевыми защитными реакциями насекомых, способными остановить развитие грибной инфекции [3, 5].
Экдизон – это гормон насекомых, обусловливающий наступление и прохождение линьки, а также склеротизацию покровов. Продуцируются проторакальными железами. Процесс линьки – смены кутикулярного покрова - является наиболее уязвимым моментом для насекомого, гриб и любой другой патоген легко может проникнуть через тонкие, еще не склеротизированные покровы [4, 6].
Усовершенствование существующих и создание новых биопрепаратов становиться все более актуальным в связи с недавно принятым законом об Органическом земледелии, где возможно применение только биологических и экологически чистых препаратов. Таким образом, становится актуальным поиск различных биологических добавок, снижающих активность защитных систем насекомых и изучение их влияния на восприимчивость насекомых к энтомопатогенам.
Цель исследования – изучить влияние синтетического экдизона и его модификанта на иммунный ответ личинок большой вощинной огневки Galleria mellonella и чувствительность к грибной инфекции Metarhizium brunneum.
Методика исследований.
Работа выполнена на базе лаборатории Биологической защиты растений и биотехнологии Новосибирского ГАУ. Объектом для исследований служили личинки большой вощинной огневки Galleria mellonella L. (Lepidoptera, Pyralidae) третьего возраста из лабораторной популяции.
Гормон (20-гидроксиэкдизон) и его модификанты предоставлены институтом биохимии и генетики УНЦ РАН (г. Уфа). Гормон (20-гидроксиэкдизон) и его модификант скармливали насекомым путем добавления в искусственную питательную среду, на которой содержались насекомые. Заражение насекомых грибом M. brunneum проводилось на третьи сутки после скармливания гормона, заражение осуществляли перкутанно - окунанием насекомых в суспензию гриба. Оценку смертности проводили ежедневно в течение 16 суток. Насекомых содержали по 10 штук в пластиковых чашках Петри при 28°С, в темноте на искусственной питательной среде.
Интенсивность процессов инкапсуляции оценивали по оригинальной методике с использованием нейлоновых имплантантов (длиной 2.0 мм, диаметром 0.5 мм). Интенсивность процессов инкапсуляции оценивали на 3 сутки после заражения грибом. Имплантанты вводили под кутикулу насекомых с вентральной стороны, через 2 ч извлекали, фотографировали и оценивали степень потемнения с помощью программы Image Pro (Dubovskiy et al., 2010).
Работа выполнена на базе лаборатории Биологической защиты растений и биотехнологии Новосибирского ГАУ. Объектом для исследований служили личинки большой вощинной огневки Galleria mellonella L. (Lepidoptera, Pyralidae) третьего возраста из лабораторной популяции.
Гормон (20-гидроксиэкдизон) и его модификанты предоставлены институтом биохимии и генетики УНЦ РАН (г. Уфа). Гормон (20-гидроксиэкдизон) и его модификант скармливали насекомым путем добавления в искусственную питательную среду, на которой содержались насекомые. Заражение насекомых грибом M. brunneum проводилось на третьи сутки после скармливания гормона, заражение осуществляли перкутанно - окунанием насекомых в суспензию гриба. Оценку смертности проводили ежедневно в течение 16 суток. Насекомых содержали по 10 штук в пластиковых чашках Петри при 28°С, в темноте на искусственной питательной среде.
Интенсивность процессов инкапсуляции оценивали по оригинальной методике с использованием нейлоновых имплантантов (длиной 2.0 мм, диаметром 0.5 мм). Интенсивность процессов инкапсуляции оценивали на 3 сутки после заражения грибом. Имплантанты вводили под кутикулу насекомых с вентральной стороны, через 2 ч извлекали, фотографировали и оценивали степень потемнения с помощью программы Image Pro (Dubovskiy et al., 2010).
Результаты исследований.
В результате проведенных исследований были получены следующие данные.
Скармливание синтетического 20-гидроксиэкдизона личинкам вощинной огневки G. mllonella не вызывало смертности, достоверного снижения массы личинок, задержки развития и/или задержки окукливания насекомых.
Топикальное заражение насекомых грибом M. brunneum приводило к гибели 40% насекомых (рис. 1). Скармливание гормона с последующим заражением грибом приводило к достоверному (р=0,05) увеличению процента гибели до 62% насекомых по сравнению с отдельным заражением грибом. При варианте со скармливанием модифицированного гормона насекомым с последующим заражением грибом гибель насекомых достигала 100% (рис. 2).
В результате проведенных исследований были получены следующие данные.
Скармливание синтетического 20-гидроксиэкдизона личинкам вощинной огневки G. mllonella не вызывало смертности, достоверного снижения массы личинок, задержки развития и/или задержки окукливания насекомых.
Топикальное заражение насекомых грибом M. brunneum приводило к гибели 40% насекомых (рис. 1). Скармливание гормона с последующим заражением грибом приводило к достоверному (р=0,05) увеличению процента гибели до 62% насекомых по сравнению с отдельным заражением грибом. При варианте со скармливанием модифицированного гормона насекомым с последующим заражением грибом гибель насекомых достигала 100% (рис. 2).
Рис. 1
Рис. 2
Для изучения воздействия 20-гидроксиэкдизона на иммунный ответ насекомых было проведено изучение интенсивности инкапсуляции у личинок вощинной огневки.
Показано, что скармливание гормона насекомым приводит к достоверному (р = 0,043) снижению интенсивности инкапсуляции по сравнению с контролем (рис. 3). Заражение грибом M. brunneum не вызывает снижения интенсивности инкапсуляции по сравнению с контролем.
Скармливание гормона с последующим заражением грибом достоверно (р = 0,05) снижает интенсивность инкапсуляции по сравнению с контролем и вариантом с заражением насекомых грибом. Скармливание модифтицированного гормона с последующим заражением грибом достоверно (р = 0,05) снижает интенсивность инкапсуляции по сравнению с отдельным заражением грибом (рис. 3).
Показано, что скармливание гормона насекомым приводит к достоверному (р = 0,043) снижению интенсивности инкапсуляции по сравнению с контролем (рис. 3). Заражение грибом M. brunneum не вызывает снижения интенсивности инкапсуляции по сравнению с контролем.
Скармливание гормона с последующим заражением грибом достоверно (р = 0,05) снижает интенсивность инкапсуляции по сравнению с контролем и вариантом с заражением насекомых грибом. Скармливание модифтицированного гормона с последующим заражением грибом достоверно (р = 0,05) снижает интенсивность инкапсуляции по сравнению с отдельным заражением грибом (рис. 3).
Рис. 3
Можно предположить, что при воздействии на организм насекомого 20-гидроксиэкдизона и его модификанта происходит снижение защитных механизмов насекомых, а именно снижение интенсивности инкапсуляции, и условия для проникновения и инфицирования грибным патогеном становиться более благоприятные.
Заключение.
Показано, что скармливание синтетического 20-гидроксиэкдизона и модифицированного 20-гидроксиэкдизона вызывает снижение интенсивности инкапсуляции, как одного из ключевых компонентов иммунного ответа насекомых при развитии грибной инфекции, и приводит к увеличению чувствительности насекомых к грибу M. brunneum.
Показано, что скармливание синтетического 20-гидроксиэкдизона и модифицированного 20-гидроксиэкдизона вызывает снижение интенсивности инкапсуляции, как одного из ключевых компонентов иммунного ответа насекомых при развитии грибной инфекции, и приводит к увеличению чувствительности насекомых к грибу M. brunneum.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Дубовский И. М. / Эволюция резистентности вощинной огневки Galleria mellonella (L.) к энтомопатогенным бактериям Bacillus thuringiensis и грибам Beauveria bassiana: дис. д-ра биол. наук: 03.02.05. // Новосибирск, 2015. — 287 с.
2. Grizanova E.V., Dubovskiy I.M., Whitten M.M., Glupov V.V. 2014 / Contributions of cellular and humoral immunity of Galleria mellonella larvae in defence against oral infection by Bacillus thuringiensis // J Invertebr Pathol. 13; 119 P:40−46
3. Dubovskiy I.M., Gryzanova E.V.; Chertkova E.A.; Slepneva I.A., Komarov D.A. Vorontsova Y.L., Glupov V.V. / 2010. Generation of reactive oxygen species and antioxidants activity in hemolymph of Galleria mellonella (L.) (Lepidoptera: Piralidae) larvae during encapsulation // Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology, 46, № 1. pp. 35−43.
4. Dubovskiy I.M., Whitten M.M.A., Yaroslavtseva O.N., Greig C., Kryukov V.Y., Grizanova E.V., Mukherjee K., Vilcinskas A., Glupov V.V., Butt T.M. / 2013 Can Insects Develop Resistance to Insect Pathogenic Fungi? // PLoS ONE 8(4): e60248.
5. Grizanova E.V., Semenova A.D., Komarov D.A., Chertkova E.A., Slepneva I.A., Dubovskiy Ivan M. / 2018. Maintenance of redox balance by antioxidants in hemolymph of the greater waxmoth Galleria mellonella larvae during encapsulation response. Arch. Insect Biochem. Physiol, 98(4): e21460. DOI:10.1002/arch.21 460
6. Arnold De Loof, Bart Boerjan, Ulrich R. Ernst, Liliane Schoofs. The mode of action of juvenile hormone and ecdysone: Towards an epi-endocrinological paradigm // General and Comparative Endocrinology. Vol. 188, 1 July 2013, P. 35−45.
1. Дубовский И. М. / Эволюция резистентности вощинной огневки Galleria mellonella (L.) к энтомопатогенным бактериям Bacillus thuringiensis и грибам Beauveria bassiana: дис. д-ра биол. наук: 03.02.05. // Новосибирск, 2015. — 287 с.
2. Grizanova E.V., Dubovskiy I.M., Whitten M.M., Glupov V.V. 2014 / Contributions of cellular and humoral immunity of Galleria mellonella larvae in defence against oral infection by Bacillus thuringiensis // J Invertebr Pathol. 13; 119 P:40−46
3. Dubovskiy I.M., Gryzanova E.V.; Chertkova E.A.; Slepneva I.A., Komarov D.A. Vorontsova Y.L., Glupov V.V. / 2010. Generation of reactive oxygen species and antioxidants activity in hemolymph of Galleria mellonella (L.) (Lepidoptera: Piralidae) larvae during encapsulation // Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology, 46, № 1. pp. 35−43.
4. Dubovskiy I.M., Whitten M.M.A., Yaroslavtseva O.N., Greig C., Kryukov V.Y., Grizanova E.V., Mukherjee K., Vilcinskas A., Glupov V.V., Butt T.M. / 2013 Can Insects Develop Resistance to Insect Pathogenic Fungi? // PLoS ONE 8(4): e60248.
5. Grizanova E.V., Semenova A.D., Komarov D.A., Chertkova E.A., Slepneva I.A., Dubovskiy Ivan M. / 2018. Maintenance of redox balance by antioxidants in hemolymph of the greater waxmoth Galleria mellonella larvae during encapsulation response. Arch. Insect Biochem. Physiol, 98(4): e21460. DOI:10.1002/arch.21 460
6. Arnold De Loof, Bart Boerjan, Ulrich R. Ernst, Liliane Schoofs. The mode of action of juvenile hormone and ecdysone: Towards an epi-endocrinological paradigm // General and Comparative Endocrinology. Vol. 188, 1 July 2013, P. 35−45.
INFLUENCE OF A SYNTHETIC ECDISON ON THE IMMUNE RESPONSE OF GREATER WAX MOTH GELLERIA MELLONELLA LARVAE AND SUSCEPTIBILITY TO FUNGAL INFECTION METARHIZIUM BRUNNEUM
Khudyshkina V.S.
Novosibirsk State Agrarian University
Keywords: greater wax moth, Galleria mellonella, Metarhizium brunneum, 20-hydroxyecdysone, immune response, biological plant protection.
The article is devoted to a study of the effect of 20-hydroxyecdysone and its modified hormone on the immune response of Galleria mellonella larvae and susceptibility to a fungal infection. It was shown that feeding the hormone leads to a decrease in the intensity of encapsulation and an increase in the susceptibility of insects to the fungal pathogen M. brunneum.
Novosibirsk State Agrarian University
Keywords: greater wax moth, Galleria mellonella, Metarhizium brunneum, 20-hydroxyecdysone, immune response, biological plant protection.
The article is devoted to a study of the effect of 20-hydroxyecdysone and its modified hormone on the immune response of Galleria mellonella larvae and susceptibility to a fungal infection. It was shown that feeding the hormone leads to a decrease in the intensity of encapsulation and an increase in the susceptibility of insects to the fungal pathogen M. brunneum.